16S rDNA寡核苷酸芯片鉴定致病菌的初步研究

目的：建立一种基于16SrDNA寡核苷酸芯片的检测和鉴定常见致病茵的技术。方法：以16SrDNA为靶标，针对待检细菌设计合成一系列寡核苷酸探针，制备寡核苷酸芯片。细菌DNA经通用引物扩增标记后，与芯片杂交，对杂交图谱进行分析归纳，得到一套种和属特异的检测模式。结果：以本室保存的33株茵(包括7个属15个种)进行初步检验，结果表明，种水平上的鉴定准确率为78．79％，21．21％可鉴定到属的水平。结论：该研究建立的16SrDNA寡核苷酸芯片技术可以稳定、特异地实现细菌的高通量鉴定，为进一步检测研究奠定了基础。     

蛋白质芯片制作条件的优化

目的 探讨以醛基化玻片为固相载体制备蛋白质芯片的条件。方法 蛋白质用含40％甘油的PBS稀释后点加在醛基化玻片上，室温干燥1h。4℃冰箱保存，经封闭剂封闭，PBS漂洗后，依次加入抗体，反应结果用扫描仪进行扫读。结果 以醛基化玻片为固相载体时预点10～15个点后点样均一性较好；点样后4℃冰箱保存24～48h再进行漂洗和封闭处理，所得结果的荧光测量值较高；3％BSA为封闭剂时所得图像的荧光背景值最低；点样量影响荧光信号的强度。结论 以醛基化玻片为固相载体制备蛋白质芯片时要预点15～20个点后再正式点样，点样后应4℃保存24～48h再进行漂洗和3％BSA封闭处理。     

一种快速简便的SARS冠状病毒RNA提取方法

目的　建立快速简便的SARS冠状病毒RNA提取方法。方法　采用异硫氰酸胍 玻璃粉法提取病毒RNA ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测SARS冠状病毒RNA。结果　 2 4例SARS患者的粪便和痰液标本同时采用异硫氰酸胍 玻璃粉法和QIAGEN公司的试剂盒提取SARS冠状病毒RNA ,其粪便标本RT PCR的阳性率分别为 83.3% (2 0 / 2 4 )和 10 0 .0 % (2 4 / 2 4 ) ;痰液标本RT PCR的阳性率分别为 16 .7% (4 / 2 4 )和 2 0 .8% (5 / 2 4 )。异硫氰酸胍 玻璃粉法RT PCR的阳性率与洗脱温度有关。结论　异硫氰酸胍 玻璃粉法提取SARS冠状病毒RNA简便、快速、经济 ,可用于临床。     

鼠疫菌cAMP受体蛋白对毒力相关基因yopD调控的初步研究

目的 研究鼠疫菌cAMP受体蛋白(CRP)对毒力相关基因yopD的调控情况.方法 利用芯片表达谱和实时定量RT-PCR初步判断CRP对yopD的调控,在获得纯化的his-CRP蛋白后进行体外凝胶阻滞实验(EMSA)证明CRP能否直接结合yopD启动子区, DNase I足迹实验 (DNase I footprinting assay) 确定yopD启动子区CRP结合位点序列精确序列.结果 芯片表达谱和实时定量RT-PCR实验一致证实CRP可能直接负调控yopD,EMSA证明 CRP能直接结合yopD启动子区,DNase I足迹实验确定yopD的启动子区上CRP位点的精确序列.结论 CRP可能直接负调控毒力相关基因yopD.     

检测鼠疫耶尔森菌LcrV抗体的上转换发光技术免疫层析试纸条的制备及应用

目的　本研究旨在制备一种用于检测鼠疫耶尔森菌LcrV抗体的上转换发光技术(UPT)免疫层析试纸条.方法　通过在试纸条分析膜检测带处固定抗原,质控带处固定抗体,结合垫位置半固定将上转换发光(UCP)颗粒标记的抗原,制备出了双抗原夹心模式的LcrV抗体检测UPT免疫层析试纸条.对制备成型后的试纸条进行了线性和灵敏度、准确性、及热稳定性4个方面的性能评价.最后用此试纸条检测了40份自然感染鼠疫的兔和人血清标本,并将结果与ELISA检测结果进行了比较.结果　试纸灵敏度达0.97 mg/L,对所测17份猴血清标本的检测准确度为100％,在37℃的稳定存放期为10d.试纸对40份实际血清标本的检测结果与ELISA检测结果一致.结论　试纸有良好的灵敏度和线性检测能力.     

云南鼠疫菌pYC质粒来源的探索

目的检测鼠疫近缘菌中是否存在着与鼠疫菌pYC质粒相同的核苷酸序列。方法设计4对引物,其产物长度覆盖整个的pYC质粒序列,将产物设计为探针,对近40余种鼠疫近缘菌全部的DNA进行斑点杂交。结果除用来作为对照的、分离至云南的4株鼠疫菌斑点杂交呈阳性外,其他杂交结果均为阴性。结论目前发现该质粒只存在于某些鼠疫菌中,进一步证实了我们先前的猜测,说明该质粒不是从这些近缘菌进化而来,可能是从外界获得的。     

用复性速率法测定细菌DNA的遗传同源性

众所周知,核酸分子杂交技术是现代细菌分类学研究中。一项比较可靠的鉴定指标。但目前国内外普遍采用同位素标记法进行杂交实验,这种方法除了需要特殊的防护措施以外,同位素价钱较贵也是不大理想的。为此,我们参考国外有关报导,利用国内现有条件初步建立了用分光光度计测定细菌DNA遗传同源性的实验方法。结果表明:本法操作简便,有较好的稳定性和重复性。可以代替使用同位素的方法,用作细菌分类学的一项研究手段。     

国产生物素化脱氧尿嘧啶核苷酸和光敏生物素标记DNA探针及其应用

本文报告应用国产Bio-11-dUTP(生物素化脱氧尿嘧啶核苷酸)和光敏生物素标记DNA探针,并用于细菌核酸分子杂交的初步实验结果。用亲和素一辣根过氧化物酶(A-HRP)显色表阴,通过二步缺口翻译法制备的Bio-11-dUTP探针,标记活性可达20pg,较常规一步法至少高出10倍;而光照标记的探针显色敏感性略低,为40～80pg;标记探针检测靶DNA的敏感性分别为1～2ng和5～10ng,而与无关DNA不发生非特异反应,可用于斑点杂交和菌落杂交。     

基因探针直接快速检测现场标本OI和非OI群霍乱弧菌产毒株的研究

我们利用先进的分子生物学手段研制的霍乱弧菌毒素(CT)和溶血素(HLY)基因探针,从遗传基因的水平检测致病因子,并阐明仅靠传统表型鉴定手段难以解释的问题,具有简便、快速、特异性强、敏感性高的特点,是微生物检测中新一代诊断试剂。该项研究建立了外环境样品处理的简便方法和探针直接检测标本的简化程序,首先把基因探针技术直接用于现场标本的霍乱毒素和溶