热变性温度法测定细菌DNA中G C的含量

近年来,随着分子生物学的不断发展,为细菌分类鉴定开辟了许多新途径,提供了许多新技术,如细菌脱氧核糖核酸(DNA)碱基成份分析、核酸分子杂交等。测定细菌DNA中鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的克分子百分数(Mol％)的方法,在细菌分类鉴定中是一种新方法。     

不同立克次体DNA的G+Cmol%含量分析

本文以普氏斑疹伤寒立克次体和斑点热立克次体为参照,对我国斑点热立克次体分离株的代表株 DNA 的 G+C mol%含量进行了分析比较,结果指出,斑疹伤寒群与斑点热群立克次体的 G+C mol%含量不同,分别为29.1和32.05;国内分离的精河株和内-01株分别为32.7和32.4,与参照的斑点热立克次体 Barbash 株(32.5)基本一致,054株的 G+C mol%是30.6,低于斑点热群的 G+C mol%数值,高于斑疹伤寒群的含量,揭示了该株 DNA 的 G+C 含量的特殊性,这是否意味着054株的特殊分类地位或是否是新种有待深入研究。     

应用抑制削减杂交技术进行鼠疫耶尔森菌的比较基因组研究

目的确定古典型鼠疫耶尔森菌的特有序列，为建立和完善该菌基因组分型系统提供可靠数据。方法通过抑制削减杂交技术发现差异片段并应用PCR验证。结果发现了5个在不同生物型鼠疫菌问存在差异的DNA片段，其中一个383bp的片段在来自天山山地灰旱獭、长尾黄鼠鼠疫自然疫源地的30株鼠疫菌全部阳性，而来自其它鼠疫自然疫源地的菌株全部阴性，5株假结核耶尔森菌中有2株(生物Ⅰ型和Ⅱ型)阳性。结论该383bp片段为天山山地灰旱獭、长尾黄鼠鼠疫自然疫源地的鼠疫菌所特有，此疫源地的菌株可能是我国较古老的鼠疫菌。     

基于DNA芯片的细菌基因表达谱技术的建立与评价

目的建立和优化基于全基因组DNA芯片的细菌基因表达谱技术，并用实时定量RT-PCR对此技术平台进行评价。方法提取并纯化鼠疫耶尔森菌总RNA，以六核苷酸随机引物（N6）和／或基因组特异引物（GDP）逆转录合成cDNA，用CY染料直接或间接标记后，与包括鼠疫耶尔森菌4005个ORF的全基因组芯片杂交，通过芯片扫描仪获得表达谱分析结果，归一化后进行分析。结果用实时定量PCR技术验证。结果采用N6＋GDP混合引物以间接法标记获得了较为理想的结果，表达谱技术与实时定量PER技术所得结果高度相关，证明了此技术的可靠性和实验设计与数据分析的合理性。结论合理的设计和归一化的分析方法是基于DNA芯片的细菌基因表达谱分析成功的关键，该技术的建立为细菌功能基因组研究奠定了基础。     

副溶血性弧菌基因敲除方法的建立及应用

目的 摸索出一套副溶血性弧菌基因敲除的可靠方案,副溶血性弧菌致病相关基因的敲除对深入研究其致病机制有重要意义.方法 通过融合PCR技术将目的 基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体pDS132上,将重组质粒转化大肠杆菌S17λpir中,再接合转移到副溶血性弧菌菌株内,经pDS132质粒上sacB基因的反向筛选得到突变株.结果 成功构建了副溶血性弧菌RIMD2210633菌株ΔopaR,ΔtoxR和ΔaphA三个基因突变株.结论 通过自杀载体同源重组成功获得精确敲除的无痕突变株更有利于基因功能的研究,使后续副溶血性弧菌突变株与野生株的对比研究成为可能.     

蛋白质芯片制作条件的优化

目的 探讨以醛基化玻片为固相载体制备蛋白质芯片的条件。方法 蛋白质用含40%甘油的PBS稀释后点加在醛基化玻片上,室温干燥1 h,4℃冰箱保存,经封闭剂封闭,PBS漂洗后,依次加入抗体,反应结果用扫描仪进行扫读。结果 以醛基化玻片为固相载体时预点10~15个点后点样均一性较好;点样后4℃冰箱保存24~48 h再进行漂洗和封闭处理,所得结果的荧光测量值较高;3% BSA为封闭剂时所得图像的荧光背景值最低;点样量影响荧光信号的强度。结论 以醛基化玻片为固相载体制备蛋白质芯片时要预点15~20个点后再正式点样,点样后应4℃保存24~48 h再进行漂洗和3% BSA封闭处理。     

鼠疫耶尔森菌Ⅲ型分泌系统相关蛋白β-内酰胺酶报告系统的建立

目的构建鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）Ⅲ型分泌系统（T3SS）相关蛋白β-内酰胺酶（TEM-1β-lactamases,Bla）报告基因载体,旨在运用本系统检测鼠疫菌待测蛋白能否转运至宿主细胞内。方法将TEM基因克隆入pA-CYC184载体中,构建用于鼠疫菌研究的TEM报告基因载体。把待分析的鼠疫菌基因及启动子区克隆入TEM基因上游,使鼠疫菌蛋白与TEM蛋白融合表达。将鼠疫菌基因-TEM融合表达载体电转化到鼠疫菌中,并感染HeLa细胞2 h后,加入CCF2-AM底物,在激光共聚焦显微镜下观察结果。结果与结论应用本系统检测了YopK-Bla、YscK-Bla、YscL-Bla和YscX-Bla进入宿主细胞的情况,YopK-Bla和YscX-Bla菌株感染的HeLa细胞呈蓝色,YscK-Bla和YscL-Bla菌株感染的HeLa细胞呈绿色,表明YopK及YscX可以进入宿主细胞,而YscK和YscL则不能。本研究成功地构建了适于鼠疫菌的TEM报告基因系统,该系统可作为分析其他鼠疫菌蛋白能否在感染的过程中进入宿主细胞的工具,为鼠疫菌T3SS相关蛋白致病机制研究奠定了基础。     

复合多聚酶链检测淋病奈瑟菌和溶脲脲原体

目的 评价用ＰＣＲ民时检测标梧的淋球菌和溶脲脲原体。方法 通过筛选不同引物，确定了两引物对的最佳浓度配比。结果 特异性和敏感性评价表明，该复合系统是淋菌和溶脲脲原体特异的，可分别检出２７０ｆｇ、６４ｆｇ的相应ＤＮＡ。结论 临床标本证明，复合ＰＣＲ检测淋球菌与单一ＰＣＲ结果符合率达１００％，检测溶脲脲原体与单一ＰＣＲ结果符合率达９９％。     

鼠疫菌感染兔血清中的10种重要抗体的检测分析

目的对鼠疫感染兔血清中的10种重要抗体(Ab)进行检测,寻找除F1外的其他可能用于鼠疫菌感染诊断的新靶标。方法利用一种新的基于上转发光法的十通道免疫层析检测技术(TC-UPT-LF)和另一种经典的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),同时检测了54份抗F1-Ag抗体阳性的鼠疫菌感染兔血清样品,对样品中10种靶标抗体的阳性率进行了综合分析。结果在54份鼠疫菌感染兔血清样品中抗体检出阳性率较高的有3个,依次为F1-Ab(100%)、YPO1089-Ab(75%)、YopD-Ab(72%),其余7个靶抗体阳性率都低于50%。结论在鼠疫感染的诊断中,除现有的F1外,YopD极有可能作为新的辅助诊断靶标。     

土拉弗朗西斯氏菌PCR—EIA检测技术的研究

目的：建立操作简便、结果客观的微孔板杂交－酶联显色检测土拉弗朗西斯拉菌ＰＣＲ产物的技术。方法；将ＰＣＲ产物或产物的克隆作为捕获探针包被聚乙烯微孔板，ＰＣＲ引物５‘末端生物素标记，扩增后用作探针杂交，通过比较影响微孔板杂交的包被，杂交和显色等因素，建立ＰＣＲ－ＥＩＡ技术。结果：通过比较包被缓冲液发现镁离子及其离子强度是影响ＤＮＡ包被的重要；包被的ＤＮＡ以线型质粒较佳，每孔包被３００ｎｇ左右的ＤＮＡ包