五对聚合酶链反应引物检测解脲脲原体的比较

目的筛选解脲脲原体（ＵＵ）尿素酶基因上的不同引物及扩增模板区，使扩增敏感性达到最佳。方法以ＵＵ尿素酶基因为靶序列，设计５对引物，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＵＵ１～１４个血清型和系列稀释的ＵＵ８ＤＮＡ，用ＯＬＩＧＯ程序分析引物序列与ＰＣＲ敏感性间的关系。结果不同种的引物对１４个血清型的扩增结果有差异。引物Ｕ１＋Ｂ、Ｕ１＋２、ＵＡ＋Ｂ、Ｕ２＋Ａ及Ｕ１＋Ｃ对１４个血清型的检出率分别为１００％、８６％、７８％、６４％及６４％。结论引物自由能谱之差影响着ＰＣＲ扩增的敏感性。ＵＵ１＋Ｂ引物扩增敏感性最佳     

用复合PCR检测炭疽芽孢的研究

目的 建立同时检测炭疽芽孢杆菌两具毒力相关质粒基因的复合PCR技术，并用于模拟污染土壤中炭疽芽孢的检测。方法 根据炭疽芽孢杆菌两个毒力相关质粒pX01和pX02上的水肿因子和荚膜基因设计引物，并探讨建立复合PCR同时扩增这两种基因的方法。评价其特异性和敏感性，并将炭疽芽孢杆菌疫苗株A16.R的芽孢加入土壤制备污染土壤，用复合PCR检测其中的芽孢，评价该方法的实用性。结果 我们发现在影响复合PCR的条件中，不同引物的比例与浓度条件最为关键；复合PCR检测的敏感性比单一基因PCR检测敏感性低10倍。用复合和单一PCR检测土壤中的炭疽芽孢表明，二者都能检测出0.25g土壤中的10^3个芽孢。结论 我们建立的复合PCR能够特异敏感的检测土壤中的炭疽芽孢。     

DNA探针检测痢疾杆菌和侵袭性大肠杆菌的研究——17kb和2.5kb探针及其与Sereny试验的比较

用~(32)P标记17kb和2.5kb两个侵袭基因小片段作探针、分别与168株痢疾杆菌、60株侵袭性大肠杆菌及300株沙门氏菌属等作菌落杂交。结果表明:两个探针均只与携带120—140Md侵袭性大质粒的菌株杂交,而未见与其它对照株产生非特异阳性,但17kb探针能与Is_1序列产生可见的杂交背景。Sereny试验表明,探针杂交阳性的菌株,并非都能引起豚鼠眼结膜炎;而Sereny试验阳性者,经传代保存也可转变为阴性。     

炭疽芽孢杆菌芽孢适配子的结构与亲和性分析

为了对炭疽芽孢杆菌疫苗株A．16R芽孢的适配子进行亲和性分析,体外构建了78个碱基的随机DNA库,以炭疽芽孢杆菌疫苗株A．16R芽孢为靶标,用SELEX技术进行了15轮的筛,针室的适配子库进行克隆,测序,用Macaw2.05和DNAsisv2.5软件对每一适配子的保守序列和二级结构进行分析,并用生物素－链酶亲和素－辣根酶系统检测,根据OD值的高低判定亲和力的大小,对每一适配子进行亲和力测定。结果表明,适配子的亲和力高低不一,OD值最高为1．2,最低为0．25,二级结构分析结果显示,茎环和茎等二级结构可是适配子与芽孢结合的基础;其一级结构提示有AGGGG,CCCCG,GGCTT、ACACT等保守序,上述分类与OD值的高低分布基本吻合。     

鼠疫耶尔森菌中国分离株菌体脂肪酸成分分析

目的 探讨利用脂肪酸组织对中国鼠疫耶尔森菌菌株进行分型的可能性,获得中国鼠疫耶尔森菌菌株脂肪酸组成的本底资料。方法 选择历年来从我国不同疫源地分离到的58株鼠疫耶尔森菌进行了菌体脂肪酸成分分析。并利用STATISTICA统计软件进行实验菌株的聚类分析。结果 中国鼠疫耶尔森菌菌株的主要脂肪酸分为16：0酸,环式17：0酸,3-羟基14：0酸和ω7c16:1酸以及十八碳单烯酸,与MIDI公司Sherlock系统的菌库中的数据存在一些差异。结论 实验菌株的脂肪酸成分极为接近,聚类图不能充分体现分离株在分离时间,地点以及生物型别上的差异。表明脂肪酸分析目前不适于鼠疫耶尔森菌的分型,根据实验结果,建立了中国鼠疫耶尔森菌菌株的脂肪权组成数据库。     

用UDPE技术检测和鉴定鼠疫耶尔森氏菌

我们建立了用ＵＤＧ（尿嘧啶糖基化酶）防ＰＣＲ产物污染,以两个不同基因为靶序列扩增检测同一病原菌和用微孔板杂交－酶联显色检测ＰＣＲ产物的ＵＤＰＥ（ＵＤＥ－ＤｕｐｌｅｘＰＣＲ－ＥＩＡ）技术并用于鼠疫耶尔森氏菌的检测与鉴定。结果表明,该系统可以特异地检测和鉴定鼠疫耶尔森菌,检测灵敏度可以达到１ＣＦＵ／ｍｌ。     

16S rDNA生物芯片微阵列方法检测立克次体的初步研究

目的：以16S rDNA为对象，生物芯片微阵列技术为平台，建立一种能在未知标本中快速检测6种立克次体的方法。方法：针对每种立克次体16S rDNA的可变区，分别设计和合成4条寡核苷酸探针。利用微阵列技术构建立克次体检测用生物芯片。待测立克次体染色体DNA用16S rRNA通用引物扩增掺入荧光素。然后与芯片杂交。利用各种立克次体的4条特异性探针是否全部出现杂交信号来做出判断。结果：以寡核苷酸为探针的生物芯片系统可以实现6种立克次体的检测。对伯氏考克斯体、汉氏巴尔通体、恙虫病东方体，本系统可以将其鉴定到种或属的位置。从第4号探针的不同可以将普氏立克次体和立氏立克次体这两个群区分开来。犬埃立克体检测始终为阴性，可能和没有合适的标本有关。从接到样品到判读出结果，整个检测过程大约需要4．5h。敏感性检测结果表明本法比PCR-电泳法敏感10倍。结论：利用16S rDNA生物芯片微阵列方法可以快速检测6种立克次体。     

单引物耐热链替代扩增HBV X区方法的初步探讨

目的 :以HBVX区为模型 ,对单引物耐热链替代扩增 (SDA)反应的影响因素进行初步探讨。SDA是一种等温的体外核酸扩增技术 ,其主要依据限制性内切酶识别并切割半硫酸磷酸化DNA未修饰链 (即打缺口 )以及 5′→ 3′外切酶缺陷的DNA聚合酶在切口处聚合延伸并替代下游链的特性 ,这种“打缺口—聚合 替代”不断循环往复 ,达到靶序列的扩增。方法 :以HBV为模型 ,设计一条典型的SDA引物 (含 5′悬端、BsoBⅠ酶切位点及 3′端靶序列互补区 ) ,采用耐热BsoBⅠ BstDNA聚合酶 5 3℃恒温反应体系 ,微孔板杂交检测最终产物。结果与结论 :对SDA反应的重要的影响因素进行了初步探讨 ,并实现了SDA对模板的线性扩增     

通用基因芯片检测感染性细菌方法的研究

目的：为提高临床微生物的检测速度和准确性，建立一次实验就能检测出一个样品中多个目标的方法。方法：利用生物信息学手段设计16种常见临床细菌的寡核苷酸探针，对16种临床常见微生物进行检测。结果：建立以16S rDNA为对象的基因芯片检测方法。利用寡核苷酸探针芯片对16种临床常见细菌进行检测的结果证明，大部分的细菌都可以由4条探针确定到种的位置。纯细菌菌液最低可以检测到200（铜绿假单胞菌）到235（金黄色葡萄球菌）个细胞。血液模拟标本只能得到2000到23500个细胞。染色体系列稀释灵敏度实验表明基因芯片检测比PCR－电泳灵敏10倍。混合标本盲测实验结果表明，样品中如果存在一个以上的待测对象也可以检测出来。结论：利用寡核苷酸为探针的基本芯片检测系统具有一定的种属鉴别能力，可以将本实验中提及的大部分细菌区分到种的位置。整个检测过程大约需要4．5h。