检测鼠疫耶尔森菌LcrV抗体的上转换发光技术免疫层析试纸条的制备及应用

目的　本研究旨在制备一种用于检测鼠疫耶尔森菌LcrV抗体的上转换发光技术(UPT)免疫层析试纸条.方法　通过在试纸条分析膜检测带处固定抗原,质控带处固定抗体,结合垫位置半固定将上转换发光(UCP)颗粒标记的抗原,制备出了双抗原夹心模式的LcrV抗体检测UPT免疫层析试纸条.对制备成型后的试纸条进行了线性和灵敏度、准确性、及热稳定性4个方面的性能评价.最后用此试纸条检测了40份自然感染鼠疫的兔和人血清标本,并将结果与ELISA检测结果进行了比较.结果　试纸灵敏度达0.97 mg/L,对所测17份猴血清标本的检测准确度为100％,在37℃的稳定存放期为10d.试纸对40份实际血清标本的检测结果与ELISA检测结果一致.结论　试纸有良好的灵敏度和线性检测能力.     

鼠疫菌cAMP受体蛋白对毒力相关基因yopD调控的初步研究

目的 研究鼠疫菌cAMP受体蛋白(CRP)对毒力相关基因yopD的调控情况.方法 利用芯片表达谱和实时定量RT-PCR初步判断CRP对yopD的调控,在获得纯化的his-CRP蛋白后进行体外凝胶阻滞实验(EMSA)证明CRP能否直接结合yopD启动子区, DNase I足迹实验 (DNase I footprinting assay) 确定yopD启动子区CRP结合位点序列精确序列.结果 芯片表达谱和实时定量RT-PCR实验一致证实CRP可能直接负调控yopD,EMSA证明 CRP能直接结合yopD启动子区,DNase I足迹实验确定yopD的启动子区上CRP位点的精确序列.结论 CRP可能直接负调控毒力相关基因yopD.     

鼠疫耶尔森菌菌株91001的蛋白质组学初步研究

目的建立鼠疫耶尔森菌的蛋白质组学研究方法,获得鼠疫耶尔森菌的基本蛋白质组数据。方法以对人无致病能力的布氏田鼠疫源地菌株91001为研究对象,按照溶解性的不同分别收集菌体蛋白,以3种不同方法(Shotgun-LC-MS-MS,1D-LC-MS-MS和2D-MS)进行分析,将分析数据与基于91001菌株基因组全序列建立的蛋白质理论数据库进行比对,确定91001菌株本实验培养条件下所表达的蛋白组分。结果Shotgun-LC-MS-MS方法鉴定了971种蛋白,1D-LC-MS-MS鉴定了915种,而2D-MS方法则鉴定了233种蛋白质,三者合计为1193种蛋白质,占基因组预测CDS的28．7％(1193／4143)。结论不同的蛋白质组分析方法鉴定的蛋白质种类和数目都存在差异,为更全面地获得鼠疫耶尔森菌蛋白质组数据,有必要同时采取多种方法进行分析。     

聚合酶链反应-微孔板杂交技术用于结核分枝杆菌的检测

目的建立结核分枝杆菌的ＰＣＲ酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）方法，使ＰＣＲ结果判定更加客观。方法我们使用玻璃粉吸附提纯模板ＤＮＡ，将ＰＣＲ引物５′端标记生物素，用ＰＣＲ产物与微孔板中预先包被的克隆靶基因杂交，然后用酶标链霉亲和素与杂交体中的生物素结合，最后用酶底物与所标记酶进行显色反应，通过测定其吸光度来判断结果。结果所建立的ＰＣＲＥＬＩＳＡ检测法可提高检测的灵敏度和特异性。对５０份来自结核病人高度怀疑有结核分枝杆菌的标本检测表明，ＰＣＲＥＬＩＳＡ检出２２份阳性，比抗酸染色法（７／５０）、培养法（１３／５０）和ＰＣＲ电泳法（１８／５０）检出率高，而２０份证实无结核分枝杆菌的标本，几种方法检查均为阴性。结论该法可敏感、特异和客观地检测临床标本中的结核分枝杆菌。