Hsa-mir-196b慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建Has-mir-196b慢病毒表达载体并对其进行鉴定.方法 以正常人外周血DNA为模板,PCR扩增得到目的基因.通过却Hpa I/Xho I双酶切及其后的连接将其插入Lentilox 3.7(pLL-3.7)质粒中.PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用pLL-3.7-mir-196b、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三质粒系统共感染HEK-293FT细胞,包装生产慢病毒.将所得病毒悬液梯度稀释后感染HEK293FT细胞,以检测病毒滴度,并用实时定量PCR检测慢病毒感染后Has-mir-196b的表达变化.结果 PCR及测序结果证明成功构建了pLL-3.7-mir-196b重组质粒.所得慢病毒上清滴度为(7.2±101)×107TU/ml.感染慢病毒的239FT细胞中,Has-mir-196b的表达量相对于未感染细胞提高了约24倍.结论 成功构建Has-mir-196b慢病毒表达载体.     

普通级、SPF级SD大鼠、Wistar大鼠血常规的测定与比较

目的　测定普通级、SPF级SD大鼠、Wistar大鼠血常规指标并进行比较。方法　Coulter -JT全自动血常规检测仪自动检测。结果　普通级、SPF级SD大鼠白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、血小板计数、血小板平均分布宽度、红细胞平均分布宽度相差非常显著 (P <0 0 1) ;中性粒细胞、单核细胞相差显著 (P <0 0 5 )。普通级、SPF级Wistar大鼠白细胞计数、中性粒细胞、单核细胞、红细胞计数、红细胞平均体积、平均红细胞血色素量相差非常显著 (P <0 0 1) ;血红蛋白、血小板计数、血小板平均分布宽度相差显著 (P <0 0 5 ) ,其他指标相差不显著。结论　不同微生物学环境对SD、Wistar大鼠血常规指标有较大影响     

胚胎植入前遗传学诊断的研究进展

自从1990年首例植入前遗传学诊断(PGD)应用于临床以来，这项技术在多个临床生殖中心迅速的开展起来，对于辅助生殖技术(ART)产生了巨大影响，这主要得益于人类对遗传性疾病认识的深入和分子诊断技术的不断提高，综述了这些遗传学检测技术的新进展，并对存在的问题和发展的前景做了进一步的阐述和展望。     

抑癌基因PTEN的结构、功能、作用机制及其研究现状

人类多种肿瘤染色体的 1 0ｑ2 3及其附近存在广泛而频繁的缺失 ,而野生型的 1 0号染色体能较好地抑制如ＧＭＢ细胞在裸鼠中的致瘤性 ,提示 1 0ｑ2 3可能存在抑癌基因[1] 。 1 997年 ,不同的研究小组从 1 0ｑ2 3定位克隆到了ＰＴＥＮ/ＭＭＡＣ1 /ＴＥＰ1 ,其编码的蛋白类似于双重特异性ＰＴＰｓ ,且在胞浆中表现出双重特异性磷酸酶活性(ＤＳＰ) [2 ] ,被认为是一种抑癌基因。同时 ,ＰＴＥＮ不仅是发现的第一个ＰＴＰ超家族中以磷酸肌醇为生理底物的磷酸酶 ,而且 ,与抑癌基因表达产物大多为核调控因子不同的是 ,其表达产物的调节作用在胞浆内…     

大肠杆菌poly(A)化mRNA cDNA文库的构建与鉴定

目的构建和鉴定大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库。方法应用限制性显示PCR技术构建大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库,筛选、收集cDNA片段,并进行测序。根据测序结果进行初步的生物信息学分析和结果验证。结果构建了大肠杆菌poly(A)化mRNA的限制性cDNA文库,并对其中66个基因片段进行了分析。结论所构建的大肠杆菌poly(A)化mRNA的cDNA文库片段重复性低,质量高。     

基因芯片技术检测丁型肝炎病毒的研究

目的 制备检测丁型肝炎病毒(HDV)基因芯片。方法 针对HDV基因保守区域设计多对PCR引物。用芯片点样仪将PCR产物点到玻片上制成基因芯片。样品标记采用限制性显示技术，样品标记后进行杂交。结果 运用PCR技术得到多个HDV特异性基因片段，序列分析表明，所扩增的片段均属于HDV特异基因。杂交结果显示，样品和HDV诊断基因芯片杂交的敏感性和特异性均佳。结论 用基因芯片检测HDV具有敏感、高效、检测结果可靠的优点，有着较大的应用前景。     

含人自噬基因hAPG12穿梭载体构建及其在酵母自噬中的作用

目的该研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母穿梭栽体pESC—URA—EGFP—hAPG12，将构建好的栽体转化到酵母菌内．以此研究hAPG12在酵母自噬过程中的作用。方法从pEGFP-C2-hAPG12中扩增出EGFP—hAPG12融合基因，鉴定正确后定向亚克隆到大肠杆菌一酿酒酵母穿梭载体pESC—URA中，构建载体pESC—URA—EGFP—hAPG12并将其转化到酵母，荧光显微镜下观察，用自噬诱导剂诱导酵母自噬以观察hAPG12在酵母内的表达定位。结果证实EGFP-hAPG12基因已完全正确亚克隆到pESC—URA中，荧光显微镜观察结果证明EGFP—hAPG12融合蛋白在酵母中成功表达，以诱导培养24h的荧光最强。EGFP—hAPG12定位于酵母的自噬体中。结论成功构建了具有报告基因的重组真核表达栽体pESC—LIRA—EGFP—hAPG12；EGFP—hAPG12融合蛋白在酵母中得到表达，hAPG12在酵母自噬体形成过程中起作用。     

鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1在酿酒酵母中的同源重组及初步鉴定

目的研究新型的防治鼠疫的基因疫苗。方法将鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1构建至pHSS6-mTn-3xHA／lacZ转座文库质粒中，将此重组质粒经Not Ⅰ酶切线性化，然后以醋酸锂法转化至酵母细胞中进行同源重组，再以尿嘧啶缺陷型培养基对阳性转化子进行筛选。结果转化子经菌落PCR方法分析鉴定，证明其为重组阳性转化子。结论以同源重组方式构建酿酒酵母表达系统，用以表达鼠疫杆菌F1表面抗原，为经消化道途径实现对鼠疫的基因防治创造条件。     

应用70mer Oligo基因芯片从限制性cDNA片段中钓取目的基因

目的 探讨采用单一探针寡核苷酸阵列从经限制性显示方法制备的cDNA片段中钓取目的基因片段的方法。方法 酵母经常规培养，抽提mRNA逆转录成cDNA后，经限制性显示技术制备成限制性cDNA片段，根据目的基因SSAl设计70mer特异性oligo片段并打印成为寡核苷酸阵列。采用荧光标记的通用引物对上述经限制性显示技术获得的限制性cDNA片段进行标记，与oligo阵列杂交，洗脱，扫描：然后进行杂交后剥除．收集剥除液．采用限制性通用引物扩增，产物克隆于PUC18T载体中，并转化至JM109大肠杆菌中培养，抽提质粒，进行测序鉴定。结果 测序结果BLAST同源性比较表明，用该方法成功的克隆出了目的基因片段。结论 采用70mer寡核苷酸芯片可以直接从限制性显示方法处理的cDNA片段中钓取目的基因，而无需构建cDNA文库。另外，本方法也可用于oligo芯片的杂交后对有表达差异的基因的获取及研究中。     

靶向COL1A1基因的 shRNA对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与凋亡的影响

 目的：探讨抑制Ⅰ型胶原α1链（COL1A1）基因表达对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及凋亡的影响。方法：用已构建的pSilencer2.1-U6-COL1A1重组质粒转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,采用RT-PCR和Western blotting技术检测重组质粒对COL1A1基因表达的影响,MTT比色法测定细胞增殖的抑制情况,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的变化,Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化。结果：RT-PCR及Western blotting结果证实重组质粒在mRNA和蛋白水平分别显著抑制COL1A1基因表达;pshRNA-COL1A1转染组细胞的增殖速度明显减慢且呈时间依赖关系;与对照组相比,pshRNA-COL1A1组细胞明显阻滞于G₀/G₁期,细胞凋亡率显著升高（P<0.05）,出现细胞质浓缩、核凝聚等凋亡形态学变化。结论：pshRNA-COL1A1能有效抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,并诱导其凋亡,为以COL1A1为靶点的乳腺癌基因治疗提供实验依据。