抗重组人表皮生长因子单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

目的　制备出高效价的抗重组人表皮生长因子 (EGF)单克隆抗体。方法　以重组人表皮生长因子作为抗原 ,免疫Balb/c小鼠 ,以未免疫的Balb/c小鼠脾细胞为饲养细胞 ,运用细胞杂交瘤技术制备 ,间接ELISA法筛选产生针对人表皮生长因子的单克隆抗体细胞株 ;以体内诱生法产生腹水 ,并采用ProteinA Sepharose柱对其纯化 ,快速定性试纸鉴定McAb的Ig亚类 ,采用间接ELISA法相加实验鉴定抗原识别表位。结果　获得 3株产生针对人表皮生长因子的单克隆抗体细胞株EGF B2 、EGF C7、EGF A8,Ig亚分别为IgG1κ型 ,IgG1λ型 ,IgG3 κ型 ,亲和力常数分别为 2 .76× 10 10 、3.2× 10 9、1.4 5× 10 9。结论　成功制备 3株稳定分泌抗rhEGF的杂交瘤细胞株 ,产生的McAb特异性好 ,亲和力高 ,为探讨EGF的作用机制及临床应用奠定了基础 ,为肿瘤的诊断与治疗提供具有实用价值的研究工具 ,此外 ,为EGF的纯化提供实验材料     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7 espA基因的克隆与表达

目的 通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7的EspA蛋白，并分析其免疫学性质。方法 采用PCR技术从EHEC O157：H7基因组中扩增espA基因，T／A法克隆，连接至pET-28a（＋）载体上，转化宿主细胞E．coli BL21（DE3），IPTG诱导表达，亲和层析法纯化目的蛋白，SDS-PAGE测定其相对分子质量，同时分析其N端氨基酸序列，免疫家兔鉴定其抗原性。结果 重组espA基因片段的测序结果与GenBank上基因序列只有1个碱基不同，一致性为99．83％，所编码的氨基酸序列没有改变。重组EspA蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达，表达量约30％。免疫家兔所得抗体滴度为1：32。结论构建高效表达EspA蛋白的重组载体pET-28a（＋）-espA，表达的蛋白具有良好的免疫原性，为进一步制备亚单位疫苗奠定基础。     

重组幽门螺杆菌疫苗口服免疫BALB/c小鼠的研究

目的研究重组幽门螺杆菌疫苗口服免疫BALB/c小鼠后免疫保护效果和维持时间，并初步探讨其免疫机制。方法ELISA检测特异性抗体水平；同时ELISPOT检测派伊尔结特异性抗体分泌细胞；RT-PCR显示T淋巴细胞IFN-γ、IL-4 mRNA表达差异；以培养、组织切片、尿素酶试验结果判断攻毒保护率。结果(1)疫苗组在胃、肠、气管冲洗液和血清产生高水平抗体；(2)疫苗组小鼠派伊尔结特异性抗体分泌细胞显著升高(P=0)；(3)抗原刺激后，免疫组T淋巴细胞的IFN-γ、IL-4 mRNA表达量升高；(4)免疫组攻毒保护率为86．7％-92．8％，且至少维持30周。结论重组幽门螺杆菌疫苗口服免疫小鼠后有良好的预防Hp感染作用；疫苗诱导的可能是TH1／TH2型免疫应答。     

重细胞分泌可溶怀IL—2R的动态检测及放免分析

ＩＬＩＳＡ检测表明：重组ＣＨＯ细胞产生的ＩＬ－２Ｒａ分子主要分布在细胞膜上，少量分泌到膜外成为可溶性ＩＬ－２Ｒ（ ｓＩＬ－２Ｒ）。ｓＩＬ－２Ｒ产生的时相与膜ＩＬ－２Ｒａ相似，但后有一个较长的高浓度稳定期。此结果提示：膜ｓＩＬ－２Ｒａ代谢比培养液中ｓＩＬ－２Ｒ明显活跃，但ｓＩＬ－２Ｒ的水平并不随膜ＩＬ－２Ｒａ含量增加而改变，ｓＩＲ－２Ｒ这种恒定的代谢方式可能包含着独特的免疫生物学意义。放免受体分析     

幽门螺杆菌双亚单位基因疫苗的构建及免疫原性研究

目的：构建幽门螺杆菌（Hp）两个保护性亚单位UreB、HspA融合基因疫苗并观察其免疫原性。方法：从Hp基因组分别扩增出UreB、HspA基因片段,采用重叠延伸PCR方法将两个基因片段构建融合基因,以BglⅡ和XhoⅠ酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,经测序确认后转染COS-7细胞,Western blot检测目的蛋白表达,胫前肌注射免疫小鼠后收集血清检测特异性抗体效价。结果：经测序后证实成功将融合基因构建到真核表达载体中,免疫印记检测到目的蛋白表达,并具有良好的抗原性,免疫小鼠后能够产生特异性抗体。结论：成功构建Hp双价DNA疫苗,免疫小鼠后显示出良好的免疫原性,为Hp进一步基因疫苗的研究奠定了基础。     

Th17：新兴的辅助T细胞

Th17近来逐渐被认为是一个独立的辅助T细胞亚群, 以分泌IL-17主要特征.Th17在防御胞外细菌感染的免疫应答、介导慢性炎症和自身免疫性疾病的发病机制中发挥重要作用.对Th17的进一步深入研究可以加深我们对相关疾病发病机制的认识并指导临床治疗.     

抗重组人白细胞介素18单克隆抗体的制备与特性研究

目的 :获得有生物活性的小鼠抗重组人白细胞介素 18(rhIL 18)单克隆抗体。方法 :采用重组hIL 18免疫BALB C小鼠 ,应用杂交瘤技术 ,ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株并经多次克隆化。结果 :建立了 2株小鼠抗hIL 18单克隆抗体杂交瘤细胞 1C7和 1F5 ,染色体数目分别为 92条和 90条 ,所分泌的抗体分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型 ,腹水IgG抗体经亲和层析法纯化后纯度达 95 %以上 ,效价为 1× 10 - 4和 1× 10 - 5,Westernblot显示 2株单抗均能特异性识别 18 3kD处的rhIL 18蛋白。 1C7单抗的亲和常数Ka=1 7× 10 5,1F5的亲和常数Ka=1 3× 10 5。 2株单抗识别不同抗原表位。结论 :制备的 2株单抗为进一步研究IL 18的分子结构、生物学功能及其与免疫相关性疾病的关系提供了实验材料。     

Stx2B与IntiminC300融合蛋白的构建、表达及免疫保护研究

目的　构建表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 57∶H7志贺毒素Ⅱ结合亚单位 (Stx2B)与紧密黏附素C 端免疫保护性片段 (IntiminC30 0 )的融合蛋白 (Stx2B IntiminC30 0 ) ,并观察其免疫保护作用。方法　设计引物采用PCR法自EHECO1 57∶H7基因组扩增Stx2B的编码基因stx2b ,T A克隆后在前期已构建原核表达质粒 pET 2 8a( + ) eaeC30 0的基础上构建融合基因表达质粒 pET 2 8a( + ) stx2b eaeC30 0 ,经测序鉴定后转化E .coliBL2 1 (DE3) ,IPTG诱导表达 ,PAGE检测 ;通过包涵体洗涤与阴离子柱层析纯化 ,获得目的蛋白Stx2B IntiminC30 0 ,以Al(OH ) 3为佐剂皮下注射免疫BALB/c小鼠 ,再以EHECO1 57∶H7超声破菌液腹腔注射免疫后的小鼠 ,观察攻毒保护效果。结果　PCR法自EHECO1 57∶H7基因组扩增出了约 2 90bp的目的片段 ;原核表达质粒 pET 2 8a( + ) stx2b eaeC30 0经酶切及测序鉴定与设计序列一致。转化E .coliBL2 1 (DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约 2 5% ;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量 (Mr)约 4 3× 1 0 3,破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达。纯化后目的蛋白Stx2B IntiminC30 0的纯度达 75% ,免疫BALB/c小鼠后血清特异性抗体阳转率及抗体效价均显著增高 ,能够抵御致死剂量EHECO1 57∶H7超声破菌     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆、表达及初步应用

目的　获取重组表达人幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori ,Hp)热休克蛋白A(HspA)亚单位 ,并应用于临床诊断。方法　利用PCR技术扩增HpHspA基因 ,将其构建至PinPointTMXa 3载体中进行诱导表达 ,并对其产物进行SDS PAGE、免疫印迹等检测。同时 ,将纯化的重组蛋白结合ELISA方法对幽门螺杆菌感染患者清除治疗前后血清中的抗HspA抗体进行检测。结果　所克隆的HspADNA由 3 5 4个碱基组成 ,可编码 118个氨基酸残基的多肽 ,SDS PAGE和免疫印迹显示所表达的蛋白分子量约为 14× 10 3 ,并可与相应的抗血清发生特异反应 ;ELISA结果发现 ,消化性溃疡患者在清除治疗后早期只出现明显的抗HspA抗体滴度下降 ,而抗幽门螺杆菌抗体要在治疗后 6月才出现明显下降。结论　重组表达HspA为诊断、预防和治疗幽门螺杆菌的进一步研究奠定了重要实验基础     

大肠杆菌LTB与幽门螺杆菌HSPA融合表达载体的构建与表达

目的 构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的包涵体形式融合表达载体。方法 PCR扩增LtB基因,并在其5' 端去掉信号肽,3'端去掉终止子,引入编码YPQD接头,通过PstI BamHI酶切位点重组于PinPoint^TM Xa- Ⅲ载体上,转化E.coli JM109,SDS－PAGE及Western-blot分析其表达。结果 成功构建了LTB融合表达质粒,并将幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与之融合获得了表达。结论 LTB融合表达载体的成功构建为研究分子内粘膜佐剂特性奠定了基础。