三种LT突变体的幽门螺杆菌疫苗黏膜免疫佐剂效应比较

目的 探讨3种大肠杆菌不耐热肠毒素突变体在辅佐幽门螺杆菌候选疫苗尿素酶B亚单位(rUreB)中的佐剂效应.方法 各组Balb/c小鼠分别用PBS、rUreB、rUreB LTK63、rUreB LTR72、rUreB LTKR及rUreB CT进行4次口服免疫.ELISA检测胃、肠、气管冲洗液sIgA以及血清IgG亚类(IgG1,IgGa);RT-PCR差异显示T淋巴细胞IFN-γ、IL-4 mRNA;ELISPOT检测肠派伊尔氏结IgA、IgG抗体分泌细胞.结果 ①各rUREB加突变体佐剂组在胃、肠、气管的sIgA和血清IgG1、IgG2a水平显著高于PBS组和单独rUreB组(P＜0.01);②抗原刺激后取自各rUreB加突变体佐剂组T淋巴细胞表达的IFN-γ、IL-4 mRNA显著高于PBS组和rUreB组(P＜0.01);③各rUreB加突变体佐剂组小肠派伊尔氏结抗体分泌细胞数都显著高于PBS组和单独rUreB组(P＜0.01).结论 3种突变体都能辅佐rUreB在小鼠上产生特异的抗rUreB的抗体,且3种突变体诱导的免疫应答可能都是Th1/Th2型.LTR72的佐剂效应强于LTK63及LTKR.LTKR无毒,其稳定性高于LTR72,佐剂活性高于LTK63,是一个有希望的新型黏膜免疫佐剂.     

幽门螺杆菌表位疫苗的设计、构建、表达及其免疫原性研究

目的 设计幽门螺杆菌（Hp）的表位疫苗并对其免疫原性进行研究。方法 将Hp的尿素酶B亚单位的三个Th表位及一个B细胞表位串联,表位之间用两个赖氨酸（KK）间隔,合成全基因,克隆到pET-22b载体上,在大肠杆菌B121（DE3）中表达;表达的重组蛋白经鉴定纯化后皮下免疫Balb／c小鼠,检测细胞免疫应答及体液免疫应答。结果 克隆表达的重组表位疫苗蛋白纯化后纯度达到95％,经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白,Th表位多肽（U546-561、U229-244、U237-251）、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖（SI〉2）,并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体。结论 本研究中表位疫苗的设计方法能够使疫苗中包含的四个表位均发挥功能,并且具有较强的免疫原性,为研究Hp预防性和治疗性疫苗提供实验基础。     

抗重组志贺样毒素ⅡA亚单位单链抗体的构建及表达

目的 构建重组志贺样毒素ⅡA亚单位（SLT2A）单链抗体基因（scFv）,并在大肠杆菌中进行分泌表达。方法 通过连接肽（Gly4Ser）,将已成功扩增的抗SLT2A单克隆抗体（mAb）5F3的VL和Va连接成scFv基因VH-Linker-VL并在Va基因5′端和VL基因3′端引入Sfi Ⅰ和Not Ⅰ的酶切位点,克隆至经改造的分泌性表达载体pCANTAB6His中,转化Ecoli HB2151,IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析纯化后,SDS-PAGE和Westem blot分析鉴定。结果 经限制性酶切鉴定及DNA测序分析证实,基因构建正确。SDS-PAGE和Westem blot分析表明scFv基因在大肠杆菌中得到表达,表达产物的相对分子质量为27000,与理论预期值相符,且可与相应抗原特异结合。结论 成功地实现了抗SLT2A scFv基因的原核分泌表达,为探讨0157菌感染的机制及防治研究奠定了基础。     

基于HSV-1型特异性表位的血清抗体ELISA检测方法建立与初步应用评价

目的建立并评价HSV-1型特异性抗体鉴别诊断的ELISA方法。方法以HSV-1-gG112-127型特异性表位的串联重组表达蛋白作为包被抗原,建立检测血清HSV．1特异性IgG的间接ELISA方法。同时以免疫印迹检测作为“金标准”,评价检测方法的真实性和可靠性。结果采用棋盘法确定了包被抗原、抗体的最佳浓度,建立ELISA检测方法。血清特异性IgG检测的灵敏度为91％,特异度为97．6％,阳性预测值为97％,阴性预测值为93％,符合率为94．5％,试验的一致率为98％。结论用串联重组蛋白作为包被抗原对HSV-1感染的血清进行ELISA分型检测,其特异性好。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位Th表位的免疫学特性研究

采用MHC限制性分析、ELISA方法、淋巴细胞增殖实验等方法研究幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)的H- 2~d限制性Th表位U_(546-561)、U_(229-244)、U_(237-251)的免疫学特性。发现抗I-E~d抗体能够抑制U_(546-561)对CD4~+T淋巴细胞的刺激,抗I-A~d抗体能够抑制U_(229-244)、U_(237-251)对CD4~+T淋巴细胞的刺激作用。U_(229-244)、U_(229-244)能刺激CD4~+T淋巴细胞分泌IL-4和IL-10,U_(237-251)刺激CD4~+T淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2,且U_(546-561)、U_(229-244)、U_(237-251)三个表位肽免疫BALB/c小鼠能够引起针对各自免疫多肽和rUreB的CD4~+T细胞应答。结果表明U_(546-561)为I-E~d限制性Th2表位,U_(229-244)为I-A~d限制性Th2表位、U_(237-251)为I-A~d限制性Th1表位。三个表位之间具有协同刺激效应,可以用于Hp表位疫苗的研究。     

基于单个外周血浆细胞技术筛选MRSA人源性单克隆抗体的实验研究

目的建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)人源性单克隆抗体筛选方法。方法从52份重组MRSA多价亚单位疫苗的Ⅰ期临床研究受试者血液样本中筛选出抗体滴度高的血样,利用流式细胞术分选其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中浆细胞,以mRNA为模板PCR扩增抗体重链、轻链可变区基因,通过重叠延伸PCR分别将将抗体重链、轻链可变区基因与CMV启动子、人恒定区及多聚A尾连接,构建成单克隆抗体线性表达载体,PEI瞬时转染293T细胞进行抗体表达。结果流式细胞术分选出1 120个浆细胞,筛选出了39个针对MRSA 5种保护性抗原α-溶血素(Hla)、铁离子表面决定蛋白B(Isd B)、金葡菌蛋白A(SpA 5)、肠毒素B(SEB)及锰离子结合蛋白C(Mnt C)的人源性单克隆抗体,ELISA结果显示抗体能与抗原蛋白结合。结论通过单个外周血浆细胞技术,成功筛选出了能够与抗原结合的MRSA人源性单克隆抗体,为研究MRSA治疗性人源性抗体奠定了良好基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位核酸疫苗的发酵、纯化及鉴定

目的大规模发酵、纯化幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(ureB)基因疫苗,并对纯化后的疫苗进行鉴定。方法大规模发酵DH5α(pT ureB),收获的细菌经碱裂解后,用两步离子交换层析方法分离、纯化疫苗,通过紫外分光光度计、酶切、体外转染等对疫苗进行鉴定。结果发酵幽门螺杆菌ureB核酸疫苗,并经离子交换层析方法纯化获得了高质量的疫苗。结论纯化的ureBDNA疫苗为进一步的免疫实验奠定了基础。     

氨基酸钙复合物增加大鼠骨密度的研究

目的 研究氨基酸钙复合物对ＳＤ大鼠骨密度的影响。方法 将ＳＤ大鼠随机分成６组,分别喂养氨基酸钙复合物、碳酸钙和低钙饲料,通过测量相应饲料畏养大鼠的身长和体重,钙表观吸收率,以及股骨的长度、重量、骨密度、钙含量等指标,观察氨基酸钙复合物对ＳＤ大鼠骨密度的影响。结果 ３种剂量水平氨基酸钙复合物组及２种剂量水平碳酸钙对照组大鼠的股骨长度、股骨干重、股骨骨密度、股骨骨钙含量以及身长显著高于低钙饲料对照组（     

慢性腹泻患者肠道需氧优势菌群检验及药敏性分析

目的 建立肠道需氧优势菌群检验方法,明确慢性腹泻与肠道需氧优势菌群的关系。方法：取病人和健康人新鲜粪便分别接种于ＳＳ．,Ｍａｃ Ｃｏｎｋｅｙ及血液琼脂平板上,３５℃２４～４８ｈ后从均匀分布的单个菌落取１～３种优势生长的菌落数个进行鉴定,对非大肠埃希氏菌优势菌做药敏试验。结果 慢性腹泻患者中以非大肠埃希氏菌为优势菌者占６７．０％（７３／１０９）,分离出共２２种７６株细菌、３株真菌,其中Ｇ＾－杆菌１７     

《生物技术制药》第二课堂在提高学生学习兴趣和科研素质中的作用

《生物技术制药》作为生物技术专业学生和药学专业学生的主干课程之一,在培养高素质创新型医药人才中发挥举足轻重的作用。因其课程特点,需要高等医学药学院校对课程不断地进行改革尝试。第二课堂是对主课堂教学活动的延伸、补充和发展,在提高学生综合素质方面发挥着重要作用。该研究通过对陆军军医大学93例参加《生物技术制药》第二课堂的学生进行调查,发现参加《生物技术制药》第二课堂学习后学生学习兴趣和科研素质得到显著提高,值得广泛推广。