人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析

新近研究表明:幽门螺杆菌(Ｈｐ)的尿素酶Ｂ亚单位(ＵｒｅＢ)、热休克蛋白Ａ亚单位(ＨｓｐＡ)和空泡细胞毒素(ＶａｃＡ)均是有效的抗原成分。由于Ｈｐ属微需氧菌,培养条件要求高,难以获得大量天然来源的ＵｒｅＢ,ＨｓｐＡ,ＶａｃＡ等成分。我们运用ＰＣＲ技术克隆ＨｐｈｓｐＡ基因,并构建载体对其进行序列分析。材料与方法一、材料质粒ＰｉｎＰｏｉｎｔＴＭＸａ3购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。大肠杆菌ＪＭ109及Ｈｐ菌株系本室保存菌种。ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄⅢ(宝灵曼公司),Ｔ4连接酶,ＴａｑＤＮＡ聚合酶和ＰＣＲ分子量标准(华美生物工程公司)。…     

微粒载体控释投递抗原与佐剂的应用进展

本文综述了近年来,微粒载体控释投递抗原在佐剂中的应用。     

幽门螺杆菌长期感染蒙古沙鼠模型的建立

幽门螺杆菌 (Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ,Ｈｐ)在胃炎、消化性溃疡、胃癌及胃淋巴瘤的发生中发挥着重要的作用 ,但是 ,Ｈｐ的动物感染模型一直未获成功。国内外虽有报道建立了小鼠及大鼠感染模型〔1,2〕,但或者是稳定性较差 ,或者是都采用特定的Ｈｐ菌株 Ｓｙｄ ｎｅｙｓｔｒａｉｎ 1(ＳＳ1) ,对于进一步研究Ｈｐ的致病机理和疫苗存在着一定局限性。 1996年起 ,国外陆续有学者〔3 ,4〕报道用沙土鼠建立Ｈｐ感染模型并取得较好效果的实验研究。为此 ,我们采用临床分离的Ｈｐ菌株对蒙古沙鼠 (Ｍｏｎｇｏｌｉａｎｇｅｒｂｉｌ)进行…     

单克隆抗体技术的启发式教学

单克隆体技术为二十一世纪生物研究的三大实验技术之一（另两项为生物化学分离技术和DNA重组技术）,极大地推动了医学生物学和免疫学的发展。检验医学专业也把单克隆抗体技术作为免疫学检验课程的重要内容。此技术操作一个流程需数月时间,不适地安排此内容的教学实习,一般仅限于理论课讲授,这给学生掌握此技术带来了一定困难。作通过以下教学方式的改进,使学生易于掌握这部内容,收到了一定的效果     

肠出血性大肠杆菌0157:H7 LexA蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 对EHEC 0157:H7 lexA达、纯化,并检测其免疫活性.方法 lexA基因片段插入表达载体pET22b( ),在E..coli BL21(DE3)中表达.包涵体经洗涤并用8 mol/L尿素溶解,Heparin Agrose亲合柱层析为第-步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第二步精细纯化,HPLC测定LexA蛋白的浓度,将纯化的kxA蛋白经注射途径免疫家兔,制备兔抗lexA血清,采用免疫双扩、ELISA及Western blot分析LexA的免疫活性.结果 lexA以包涵体形式表达,表达产量高达总菌体蛋白的40%左右,经Heparin Agrose亲合柱层析和凝胶过滤层析两步组合纯化目的 蛋白,经HPLC测定目的 蛋白的最终纯度为98%,表达及纯化的lexA具有良好的免疫活性.结论 在E.coli BL21(DE3)中表达的LexA蛋白具有良好的免疫活性.     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位Th表位的免疫学特性研究

采用MHC限制性分析、ELISA方法、淋巴细胞增殖实验等方法研究幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)的H- 2~d限制性Th表位U_(546-561)、U_(229-244)、U_(237-251)的免疫学特性。发现抗I-E~d抗体能够抑制U_(546-561)对CD4~+T淋巴细胞的刺激,抗I-A~d抗体能够抑制U_(229-244)、U_(237-251)对CD4~+T淋巴细胞的刺激作用。U_(229-244)、U_(229-244)能刺激CD4~+T淋巴细胞分泌IL-4和IL-10,U_(237-251)刺激CD4~+T淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2,且U_(546-561)、U_(229-244)、U_(237-251)三个表位肽免疫BALB/c小鼠能够引起针对各自免疫多肽和rUreB的CD4~+T细胞应答。结果表明U_(546-561)为I-E~d限制性Th2表位,U_(229-244)为I-A~d限制性Th2表位、U_(237-251)为I-A~d限制性Th1表位。三个表位之间具有协同刺激效应,可以用于Hp表位疫苗的研究。     

临床免疫学及免疫检验开放式实验教学方法研究

为了适应21世纪发展需要,就围绕如何培养学生实践能力及科学素养,提高学生的综合素质,对检验医学专业的临床免疫学及免疫学检验实验教学进行探索.通过开放式实验教学培养学生综合思维、创新能力.     

表达肠出血性大肠杆菌 O157:H7 EspA 抗原的减毒沙门氏菌株的构建

目的 利用平衡致死系统构建表达O157:H7 EspA 的减毒鼠伤寒沙门氏菌.方法 构建表达EspA的重组质粒,再将其转入终宿主菌减毒鼠伤寒沙门氏菌x4550 株中构建成口服活疫苗株,用IPTG进行诱导表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳、Westen-blot检测EspA蛋白的表达情况.并观察重组菌体外培养的稳定性.结果 利用宿主-载体平衡致死系统构建了表达O157:H7 EspA的重组减毒沙门氏菌,经Tricine-SDS-PAGE电泳出现了1条Mr约21 000的蛋白条带,Westen-blot检测能与抗EspA的单克隆抗体发生特异性反应.且在没有选择压力的条件下体外能稳定地繁殖、生长和传代.结论 表达O157:H7 EspA的重组减毒沙门氏菌构建成功,为发展口服抗EHEC O157:H7的疫苗奠定了初步基础.     

三种LT突变体的幽门螺杆菌疫苗黏膜免疫佐剂效应比较

目的 探讨3种大肠杆菌不耐热肠毒素突变体在辅佐幽门螺杆菌候选疫苗尿素酶B亚单位(rUreB)中的佐剂效应.方法 各组Balb/c小鼠分别用PBS、rUreB、rUreB LTK63、rUreB LTR72、rUreB LTKR及rUreB CT进行4次口服免疫.ELISA检测胃、肠、气管冲洗液sIgA以及血清IgG亚类(IgG1,IgGa);RT-PCR差异显示T淋巴细胞IFN-γ、IL-4 mRNA;ELISPOT检测肠派伊尔氏结IgA、IgG抗体分泌细胞.结果 ①各rUREB加突变体佐剂组在胃、肠、气管的sIgA和血清IgG1、IgG2a水平显著高于PBS组和单独rUreB组(P＜0.01);②抗原刺激后取自各rUreB加突变体佐剂组T淋巴细胞表达的IFN-γ、IL-4 mRNA显著高于PBS组和rUreB组(P＜0.01);③各rUreB加突变体佐剂组小肠派伊尔氏结抗体分泌细胞数都显著高于PBS组和单独rUreB组(P＜0.01).结论 3种突变体都能辅佐rUreB在小鼠上产生特异的抗rUreB的抗体,且3种突变体诱导的免疫应答可能都是Th1/Th2型.LTR72的佐剂效应强于LTK63及LTKR.LTKR无毒,其稳定性高于LTR72,佐剂活性高于LTK63,是一个有希望的新型黏膜免疫佐剂.     

幽门螺杆菌表位疫苗的设计、构建、表达及其免疫原性研究

目的 设计幽门螺杆菌（Hp）的表位疫苗并对其免疫原性进行研究。方法 将Hp的尿素酶B亚单位的三个Th表位及一个B细胞表位串联,表位之间用两个赖氨酸（KK）间隔,合成全基因,克隆到pET-22b载体上,在大肠杆菌B121（DE3）中表达;表达的重组蛋白经鉴定纯化后皮下免疫Balb／c小鼠,检测细胞免疫应答及体液免疫应答。结果 克隆表达的重组表位疫苗蛋白纯化后纯度达到95％,经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白,Th表位多肽（U546-561、U229-244、U237-251）、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖（SI〉2）,并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体。结论 本研究中表位疫苗的设计方法能够使疫苗中包含的四个表位均发挥功能,并且具有较强的免疫原性,为研究Hp预防性和治疗性疫苗提供实验基础。