人白细胞介素-18在大肠杆菌中的高效表达

目的 在大肠杆菌中实现人IL－18成熟蛋白（mhIL-18）的高效表达。方法 采用RT－PCR由人肝脏Kupffer细胞中扩增mhIL-18基因，构建非融合型原核表达质粒petTT/mhIL-18，转化至大肠杆菌DH5α，用IPTG诱导热处理重组蛋白表达，超声裂解细胞提取包涵体，采用SDS－PAGE及Western blot分析重组蛋白的表达，包涵体蛋白经8mol/L尿素溶解，透析复性，ELISA检测重组蛋白诱导人外周血单个核细胞（PBMC）产生IFN－γ的能力。结果 所扩增的mhIL-18基因与GenBank公布的序列一到，经IPTG诱导，mhIL-18在大肠杆菌中的表达量占菌体蛋白的40％以上，，在细胞中以包涵体形式存在，复性的重组蛋白具有诱生IFN-γ的能力。结论 mhIL-18可在大肠杆菌中高效表达。     

肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157∶H7志贺毒素研究进展

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7于1975年被首次分离,为革兰氏阴性杆菌,对酸耐受性强,在pH3~5条件下,可长期生存,能产生致死性志贺毒素(Shiga toxin,Stx),1982年被确认为严重致病菌。其感染具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点,已经成     

肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA与IntiminC300融合蛋白的构建表达

目的构建表达肠血性大肠杆菌（EHEC）0157：H7Ⅲ型分泌蛋白EspA与紧密粘附素G端免疫保护性片断（Intindn C300）的融合蛋白（EspA-IntiminC300）。方法采用PCR技术从EHEC0157lH7基因组中扩增EspA的编码基因espA及IntiminC300的编码基因eaeC300，T-A克·隆后依次构建至表达载体pET-28a（＋），转化宿主细胞E．coliBL21（DE3），测序鉴定，IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测其表达量及表达形式，亲和层析法纯化目的蛋白，免疫印迹分析免疫反应性。结果PCR法自EHEC0157tH7基因组中分别扩增出了约580bp（espA）和900bp（eaeC300）的目的片段，将二者融合构建了重组质粒pET-28a（＋）-espA-eaeC300，测序结果与理论预测值一致性为99．9％（1501／1502）。融合蛋白在工程菌中表达量约40％，PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量（Mr）约54×10^3Da，破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形武表达，包涵体洗涤后纯化，获得目的蛋白纯度约90％。免疫印迹显示融合蛋白能分别与兔抗EspA和IntiminC300血清发生免疫反应。结论高效表达了融合蛋白（EspA-IntiminC300），此融合蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性，为研制EHEC0157：H7多亚单疫苗奠定了基础。     

重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位鼻腔免疫凝胶剂的研制

目的研制重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗凝胶剂,考察其特性及免疫效果。方法以卡泊波为基质,脱氧胆酸钠为黏膜吸收促进剂,制备凝胶剂,以落球法测定凝胶的黏度,SDS-PAGE电泳分析脱氧胆酸钠对蛋白纯度的影响,以免疫印记检测疫苗蛋白的完整性,以留样观察法及离心法考察凝胶的稳定性,以含抗原凝胶剂鼻腔免疫BALB/c小鼠,并与溶液剂相比较,考察凝胶剂的免疫效果。结果制备的凝胶剂稳定性好,凝胶的黏度为8050mPa.s,脱氧胆酸钠不影响蛋白的纯度,抗原蛋白的完整性良好。小鼠鼻腔免疫凝胶剂后产生了较强的特异性血清IgG及胃肠sIgA反应,优于液体免疫。结论重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位凝胶剂性质稳定,具有生物黏附性,可提高免疫效果,是较好的鼻腔免疫剂型。     

临床免疫学及免疫检验开放式实验教学方法研究

为了适应21世纪发展需要,就围绕如何培养学生实践能力及科学素养,提高学生的综合素质,对检验医学专业的临床免疫学及免疫学检验实验教学进行探索.通过开放式实验教学培养学生综合思维、创新能力.     

幽门螺杆菌表位疫苗的设计、构建、表达及其免疫原性研究

目的 设计幽门螺杆菌（Hp）的表位疫苗并对其免疫原性进行研究。方法 将Hp的尿素酶B亚单位的三个Th表位及一个B细胞表位串联,表位之间用两个赖氨酸（KK）间隔,合成全基因,克隆到pET-22b载体上,在大肠杆菌B121（DE3）中表达;表达的重组蛋白经鉴定纯化后皮下免疫Balb／c小鼠,检测细胞免疫应答及体液免疫应答。结果 克隆表达的重组表位疫苗蛋白纯化后纯度达到95％,经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白,Th表位多肽（U546-561、U229-244、U237-251）、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖（SI〉2）,并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体。结论 本研究中表位疫苗的设计方法能够使疫苗中包含的四个表位均发挥功能,并且具有较强的免疫原性,为研究Hp预防性和治疗性疫苗提供实验基础。     

抗重组志贺样毒素ⅡA亚单位单链抗体的构建及表达

目的 构建重组志贺样毒素ⅡA亚单位（SLT2A）单链抗体基因（scFv）,并在大肠杆菌中进行分泌表达。方法 通过连接肽（Gly4Ser）,将已成功扩增的抗SLT2A单克隆抗体（mAb）5F3的VL和Va连接成scFv基因VH-Linker-VL并在Va基因5′端和VL基因3′端引入Sfi Ⅰ和Not Ⅰ的酶切位点,克隆至经改造的分泌性表达载体pCANTAB6His中,转化Ecoli HB2151,IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析纯化后,SDS-PAGE和Westem blot分析鉴定。结果 经限制性酶切鉴定及DNA测序分析证实,基因构建正确。SDS-PAGE和Westem blot分析表明scFv基因在大肠杆菌中得到表达,表达产物的相对分子质量为27000,与理论预期值相符,且可与相应抗原特异结合。结论 成功地实现了抗SLT2A scFv基因的原核分泌表达,为探讨0157菌感染的机制及防治研究奠定了基础。     

基于HSV-1型特异性表位的血清抗体ELISA检测方法建立与初步应用评价

目的建立并评价HSV-1型特异性抗体鉴别诊断的ELISA方法。方法以HSV-1-gG112-127型特异性表位的串联重组表达蛋白作为包被抗原,建立检测血清HSV．1特异性IgG的间接ELISA方法。同时以免疫印迹检测作为“金标准”,评价检测方法的真实性和可靠性。结果采用棋盘法确定了包被抗原、抗体的最佳浓度,建立ELISA检测方法。血清特异性IgG检测的灵敏度为91％,特异度为97．6％,阳性预测值为97％,阴性预测值为93％,符合率为94．5％,试验的一致率为98％。结论用串联重组蛋白作为包被抗原对HSV-1感染的血清进行ELISA分型检测,其特异性好。