EHECO157：H7紧密粘附素胞外特异性片段（intiminC）的表达纯化及免疫检测的初步应用

目的:克隆表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7紧密粘附素胞外特异性片段(intiminC),摸索其免疫检测的初步应用.方法:设计引物采用PCR法自EHEC O157:H7基因组扩增紧密粘附素胞外特异性片段的编码基因eaeC,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-21a( )-eaeC,经测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,PAGE检测.目的蛋白经包涵体洗涤,使用含谷胱甘肽氧化还原系统的复性缓冲液进行稀释并结合透析复性后,再用阴离子交换柱Resource Q和分子筛柱Superdex 200进行纯化.将所得高纯度目的蛋白包被ELISA酶标板,对实验动物的免疫血清进行检测.结果:PCR法自EHEC O157:H7基因组扩增出了约570 bp的目的片段;原核表达质粒pET-21a( )-eaeC经酶切及测序鉴定与设计序列-致.转化E coli BL21(DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约35%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约20×103,破菌后电泳证实目的蛋白均以包涵体形式表达.包涵体复性后目的蛋白纯化效果明显,高纯度的intiminC蛋白包被ELISA板,对实验室动物免疫血清的检测效果良好.结论:EHEC O157:H7紧密粘附素胞外特异性片段经基因克隆后获得了较好的表达,复性纯化后获得高纯度的目的蛋白intiminC,在此基础上建立的ELISA检测方法对实验室动物免疫血清的检测效果良好.为进-步的人血清抗体检测及EHEC O157:H7感染的流行病学研究奠定了基础.     

幽门螺杆菌微球疫苗非临床实验初步研究*

目的：通过考察幽门螺杆菌（Helicobacter pyliori，np）微球生物学行为，探讨其作为口服蛋白疫苗的可行性。方法：用可降解天然高分子材料一壳聚糖和海藻酸钠制备Hp全菌蛋白微球（HpWCP—CAMS），通过BCA方法测定微球中蛋白质的包裹效率及包裹量，测定微球在体外的药物释放度。并进行小鼠体内微球的靶向试验，微球的体内外毒性试验和淋巴细胞致敏试验。结果：HpWCP—CAMS中蛋白包裹量为31．5％，蛋白包裹效率为61．O％。微球中药物缓释周期可长达20d，靶向试验结果显示微球能在肠黏膜、PP结及脾脏富集并能有效诱导淋巴细胞致敏。体外毒性显示125μL微球（5mg-mL^-1）对Hela细胞生长无明显影响，体内实验结果显示其对小鼠生长也没有影响。结论：HpWCP—CAMS具有良好的靶向性和缓释特征，无细胞毒性，有望作为疫苗进一步研究。     

幽门螺杆菌UreB414-OMP18-LTB融合蛋白的构建及免疫原性初步研究

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp) 尿素酶B亚单位活性片段(UreB414)、外膜蛋白(OMP18)及大肠埃希菌LTB融合疫苗并研究其抗原性.方法 PCR扩增ureb414、omp18、ltb基因,分别克隆入pMD18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UOL,然后将其亚克隆入原核表达载体pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21,SDS-PAGE电泳进行表达,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果 PCR扩增分别获得约414、537 bp和320 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约1 200 bp目的 基因.重组融合蛋白表达量可达细菌总蛋白的15%,免疫印迹检测结果显示该重组蛋白可为UreB、OMP18、LTB兔抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论 成功构建了具有良好免疫原性的UreB-OMP18-LTB融合蛋白.     

单克隆抗体在血清幽门螺杆菌可溶性抗原检测中的应用

目的建立一种血清幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)可溶性抗原检测方法,并评价其在Hp感染诊断中的作用。方法利用抗Hp单克隆抗体,采用双抗体夹心法检测血清中可溶性Hp抗原。并对其特异性和敏感性进行分析,同时与临床常用的血清特异性抗体检测、快速尿素酶试验、涂片镜检、14C尿素呼气试验和细菌培养5种方法进行了比较,并对药物根除效果进行了评价。结果血清可溶性Hp抗原检测方法敏感性和特异性分别为96.5%和96.0%,此方法明显优于血清特异性抗体检测、快速尿素酶试验、涂片镜检和细菌培养,与14C尿素呼气试验无显著差别,药物治疗前后血清Hp可溶性抗原含量有显著差异。结论血清可溶性Hp抗原检测方法是一种简便、高敏感性和特异性检测Hp感染的方法,可用于Hp感染药物根除效果的评价。     

幽门螺杆菌疫苗候选抗原lpp20基因的克隆表达及其纯化研究

目的克隆表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)lpp20基因,为筛选预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗保护性抗原奠定基础.方法用PCR方法从临床分离株9806的染色体DNA中扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入表达载体pET22b中,重组载体pET22b-Lpp20经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E. coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果PCR扩增的lpp20基因长度为528bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因片段与GenBank公布的序列相似性达99%,SDS-PAGE显示,经IPTG诱导目的蛋白占总蛋白的19.7%,纯化后,蛋白纯度达80%以上.Western blot检测该蛋白与兔抗Hp的多克隆抗血清发生结合反应.结论成功构建了lpp20表达载体pET22b-Lpp20,并在大肠杆菌中表达.     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位Stx2A的表达与纯化

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(Enterohem orrhagic Escherichia col,i EHEC)O157∶H7志贺样毒素A亚单位(Sh iga-like toxin,Stx2A),并对其初步纯化。方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增Stx2A的编码基因stx2 a,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11 c( )-stx2 a,经测序鉴定后转化E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDS-PAGE和W esten b lot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白。结果扩增的stx2 a基因约950bp;原核表达质粒pET-11 c( )-stx2 a经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli.BL21(DE3)中得到高效表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约31×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达92.3%。结论EHEC O157∶H7 Stx2A的高效表达与初步纯化,为探讨O157∶H7菌的感染机制奠定基础。     

国产标准化一氧化氮(NO)检测试剂盒

近年来，人们发现一氧化氛（Nitricoxide，NO）在细胞内信息传递方面起着重要作用，并很快在生理学、神经科学和免疫学等许多领域证明了NO既兼有第二信使和神经递质的性能，又是杀伤肿瘤细胞及免疫调节的效应分子。NO的发现对许多生理现象和临床多种疾病的研究提供了新的认识。1992年，NO被St．cence杂志选为“明星分子”，成为当前医学科学研究的热点。由于NO在生物体内含量低，半衰期短，有外存在下极易被氧化，这就给其准确测定带来困难。目前，测定NO的方法很多，其灵敏度、特异性、应用范围等方面各有优势和不足。测定N0i或N0i…     

简便敏感的环介导等温扩增基因诊断新技术

核酸扩增是基因诊断技术中最常用的方法之一，目前核酸扩增的方法很多，如聚合酶链反应（PCR）、依赖核酸序列扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、自主序列复制（self-sustained sequence replication，3SR）以及链置换技术（strand displacement amplification，SDA）。这些方法都能将微量标本进行快速扩增，但都在特异性、简便程度、温度和试剂仪器要求等方面有缺点。     

血清特异性免疫复合物在幽门螺杆菌感染诊断中的意义

目的:建立一种血清幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)特异性免疫复合物的检测方法,并评价其在Hp感染诊断中的作用。方法:利用抗Hp单克隆抗体捕获Hp特异性免疫复合物,再用酶标羊抗人免疫球蛋白对其进行检测,并对其特异性和敏感性进行分析,同时与临床常用的血清特异性抗体检测、快速尿素酶试验、涂片镜检、14C尿素呼气试验和细菌培养5种方法进行了比较,并对药物根除效果进行了评价。结果:血清可溶性Hp抗原检测方法敏感性和特异性分别为86.0%和96.0%,此方法明显优于血清特异性抗体检测、快速尿素酶试验、涂片镜检和细菌培养,与14C尿素呼气试验差异无显著性,药物治疗前后血清Hp特异性免疫复合物含量差异无显著性。结论:血清Hp特异性免疫复合物检测方法是一种简便、高敏感性和特异性的检测Hp感染的方法,但不能用于Hp感染药物根除效果的评价。