人TSARG4真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立

目的: 构建人TSARG4基因真核表达载体,转染HeLa细胞,建立稳定转染TSARG4的HeLa细胞系.方法: 应用 RT-PCR从人睾丸中扩增TSARG4的开放阅读框(ORF),并将 PCR产物插入到pUCm-T载体中测序验证.随后,将TSARG4进一步克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中.用脂质体将经过测序、验证的pcDNA3.1(+)/TSARG4质粒转染HeLa细胞,通过G418筛选建立TSARG4稳定转染的HeLa细胞系.RT-PCR和组织原位杂交技术检测TSARG4在稳定转染的HeLa细胞系中的表达.结果: 成功构建了pcDNA3.1(+)/TSARG4表达质粒,建立了稳定转染的HeLa细胞系.RT-PCR和组织原位杂交检测结果表明,TSARG4基因在该细胞系中成功表达.结论: TSARG4真核表达载体成功构建和稳定转染HeLa细胞系的建立为进一步体外研究TSARG4的功能奠定了基础.     

湖南大围子猪内源性逆转录病毒的研究

目的：研究湖南大围子猪携带的内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV），为评价从猪到人异种移植的生物安全性提供依据。方法：从湖南大围子猪的保种群内随机采集42头个体的耳样组织，应用PCR和RT-PCR技术分别检测这些组织中PERV前病毒DNA和mRNA，并对PCR扩增的灵敏性进行评估。扩增、测序大围子猪的PERV env基因，结果用美国生物信息中心（National Center for Biotechnology Information）的BLAST软件进行分析。结果：所检测的42头大围子猪均带有PERV前病毒DNA，耳样组织中均有PERV mRNA表达，所有个体携带env-A，env-B和env-C3种囊膜蛋白基因。测序结果表明，大围子猪env-A和env-C与GenBank登录其他猪种序列（AY288779，AY534304）相比分别存在1和8个碱基的差异，而env-B基因没有碱基差异。结论：大围子猪种群携带PERV，而且均具有转录活性，亚型主要为PERV-ABC；大围子猪的PERVenv-A，env-C存在基因多态性，从生物安全性方面考虑，该猪种不宜作为异种移植供体。     

液相蛋白质芯片检测血清C反应蛋白方法的建立

目的 建立液相蛋白质芯片检测血清C反应蛋白（CRP）的方法,探讨该方法诊断冠心痛的临床应用价值。方法 用聚苯乙烯荧光微珠,将抗CRP单克隆抗体包被在微珠上,将另一针对CRP不同抗原表位的单克隆抗体生物素化;包被好的微珠加入到96孔板中,将待测血清分别加入各孔,用CRP标准品建立标准曲线,各孔中加入生物素化抗CRP单抗和PE荧光素标记的链霉亲合素。在Bio-Plex液相蛋白质芯片分析仪上检测296份血清样品。同一血清标本同时用免疫比浊法测定。比较两种方法对CRP检测的敏感性和特异性。结果 液相蛋白质芯片检测CRP方法对诊断冠心病的敏感性（78,3％）和特异性（87．1％）较免疫比浊法的敏感性（63．0％）和特异性（86．5％）高,χ^2=28,94,P〈0．001。结论 建立了一种检测血清CRP的新方法,对诊断冠心痛有临床应用价值。     

异种移植微囊化新生猪胰岛细胞受体感染PERV潜在风险分析

目的:研究新生猪胰岛细胞(neonatal pig islets,NPIs)经微囊化后异种移植到狗体内,受体感染猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)的风险.方法:将10只狗随机分成实验组和对照组,分别移植微囊化猪胰岛细胞和未被微囊化猪胰岛细胞.应用放射免疫的方法检测狗体内血清特异性猪C-肽以判断胰岛移植物活性;采用免疫组织化学技术检测28 d后肝移植部位是否有微囊化猪胰岛细胞;PCR和RT-PCR技术分别检测不同时间点狗外周血中PERV及猪mt DNA.结果:移植微囊化猪胰岛细胞2周后,给受体注射葡萄糖,15～30 min狗的外周血中猪C-肽表达明显升高,而对照组检测不到猪C-肽;免疫组化结果表明,狗肝脏移植部位周围可检测到少量微囊化猪胰岛细胞,肝组织无明显异常;PCR和RT-PCR结果表明,移植微囊化猪胰岛细胞在不同时间点狗外周血内均未检测到猪mt DNA及PERV表达,而对照组于移植后4 d内检测到猪mt DNA及PERV呈微弱表达,10 d后均未见表达.结论:微囊化猪胰岛细胞能够在受体肝脏内存活并发挥作用,受体内不存在PERV的感染,提示海藻酸钠微囊可以有效地防止猪mt DNA及PERV的穿越,可能在异种移植中具有较好的应用前景.     

GP IIb三种基因多态性之间的关系及GP IIb T13959 G在血小板输注耐受中的作用

目的:研究血小板膜糖蛋白Ⅱb (GP Ⅱb)三种基因多态性之间的关系及GP Ⅱb T13959 G在血小板输注耐受中的作用.方法:聚合酶链反应-单链构型多态性分析检测110例正常人GP Ⅱb基因第26和30外显子(Exon 26, Exon30)及21内含子(Intron21)基因多态性,进行基因序列分析,研究这些基因多态性是否存在连锁关系;应用Fok1酶切法对147例血液病人人类血小板抗原-3(human platelet antigen-3, HPA-3)基因进行分型,并与110例正常人进行比较;将接受单采血小板输注的44例血液病人随机分为HPA-3同型输注组和对照组,血小板输注3次以后检测血小板抗体.结果:正常人GP Ⅱb存在基因多态性,表现分别为gDNA 13 959位点T→G,16 977位点C→T,11 996～12 004位点9个碱基缺失,且三者具有同步性.Fox1酶切分析结果表明,正常人和血液病人的HPA-3a基因频率分别为83.6%(92/110)和81.9%(119/147),HPA-3b基因频率分别为16.4%(18/110)和19.1%(28/147),两者之间差异无统计学意义(P＞0.05).血液病人接受单采血小板输注后, HPA-3同型输注组血小板抗体阴性,而对照组有2例存在血小板抗体,其中1例为HPA-3a抗体.结论:(1)GP Ⅱb基因存在gDNA 13 959位点T→G,16 977位点C→T,11 996～12 004位点9个碱基缺失,这3个位点的多态性可能存在完全连锁关系;(2)血液病人与正常人的HPA-3基因频率相同;(3)HPA-3系统可能是我国人群产生血小板输注耐受的原因之一.     

柯萨奇病毒B3感染HeLa细胞后mTOR通路部分信号蛋白表达的变化

目的研究柯萨奇病毒B3(CVB3)感染宫颈癌细胞株(HeLa)后mTOR通路中信号分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)、p70S6激酶(p70S6K)、磷酸化真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(p-4EBP1)、磷酸化p70S6激酶(p-p70S6K)等蛋白表达的变化。方法 CVB3感染Hela细胞后3、6、9、12和24 h作为病毒组,未被CVB3感染的同时间点细胞作为对照组;运用Western blotting检测mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K、4EBP1、p-4EBP1表达的变化。结果①CVB3感染Hela细胞后,不同时间点感染后的mTOR、p-mTOR、4EBP1、p70S6K、p-4EBP1、p-p70S6K表达含量变化及与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。②通过直线相关性分析发现,病毒组mTOR与p70S6K蛋白表达之间具有正相关关系,对照组间无相关关系;病毒组mTOR与4EBP1蛋白表达之间具有负相关关系,而对照组具有正相关关系;两组间的mTOR与p-mTOR均具有正相关关系,病毒组p70S6K与p-p70S6K蛋白表达具有正相关关系,对照组无相关关系。病毒组4EBP1与p-4EBP1蛋白表达无明显相关,对照组具有正相关关系。结论 CVB3感染HeLa细胞后可抑制mTOR/p70S6K通路,激活mTOR/4EBP1通路调控细胞的生长。     

RBM5 基因表达载体构建、稳定转染A549 细胞系的建立及功能的初步研究

目的：通过构建表达载体、建立稳定转染RNA结合基序5(RNA binding motif 5,RBM5)的A549细胞系, 初步研究RBM5基因过表达对A549 细胞增殖以及天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15[DEAH box polypeptide 15,DHX15]表 达的影响。方法：应用分段克隆法构建pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体;将测序验证后的重组质粒pcDNA3.1(+)/ RBM5转染肺腺癌A549细胞并以G418进行筛选,采用Western印迹鉴定RBM5基因过表达阳性细胞,流式细胞仪分别 检测经pcDNA3.1(+)/RBM5稳定转染的A549细胞[pcDNA3.1(+)/RBM5-A549]及pcDNA3.1(+)空白质粒转染的A549细胞 [pcDNA3.1(+)-A549]的周期分布;运用RT-PCR技术分别检测pcDNA3.1(+)/RBM5-A549和pcDNA3.1(+)-A549细胞中剪 接相关因子DHX15的表达情况。结果：成功构建出pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体,筛选出RBM5基因稳定转染过 表达阳性细胞株;pcDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞处于G1期细胞比例增大、S期细胞比例减小(均 P<0.01);cDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞的DHX15表达上调(P<0.01)。结论：成功构建重组质粒 pcDNA3.1(+)/RBM5,并建立了RBM5稳定转染的A549细胞系;初步证实RBM5基因过表达可抑制肺腺癌A549细胞的细 胞周期,并使DHX15表达上调。     

血管内皮细胞衰老过程中S1P2受体表达和细胞功能改变的相关性

目的 研究衰老血管内皮细胞的功能和S1P2受体表达的相关性.方法 采用RT-PCR和Western印迹检测年轻、中年和衰老内皮细胞的S1P2受体的表达;运用细胞跨膜迁移实验分析内皮细胞的趋化性,以及采用种植在Matrigel胶上的内皮细胞的形态发生实验,评价内皮细胞体外血管新生反应.结果 S1P2受体在衰老内皮细胞中的表达显著上调(P＜0.05);S1P刺激能增加内皮细胞的迁移,但衰老组迁移率明显低于其他组(P＜0.05);Matrigel种植方法评价内皮细胞体外血管生成实验显示,S1P能刺激内皮细胞形成管状样结构,且衰老内皮细胞形成管状样结构的能力明显减弱(P＜0.05).结论 S1P通过S1P2受体介导而影响内皮细胞的功能,且衰老内皮细胞的S1P2受体表达上调与内皮细胞迁移及血管生成能力等功能下调改变相关联.     

经hCTLA4-Ig基因转染的猪胰岛细胞在小鼠体内的存活与功能状况研究

目的研究将人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白（hCTLA4-Ig）基因转染至猪胰岛细胞后，再将其移植至小鼠体内的存活及功能状况。方法采用腺相关病毒载体（AAV）介导hCTLA4-Ig基因体外转染新生猪胰岛细胞（NIPs），再将转基因的NIPs移植至构建了人免疫系统的SCID糖尿病小鼠左肾被膜下。逆转录聚合酶链（RT-PCR）反应和免疫荧光染色法检测转染后hCTLA4-Ig基因的表达状况；观察小鼠移植转基因NIPs后的生存时间；移植物免疫组织化学分析及酶联免疫（ELISA）法测定受者血清中细胞因子的水平。结果NIPs经转染后，可检测到hCTLA4-Ig基因及其蛋白表达，且葡萄糖刺激胰岛素释放试验与未转染的对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；糖尿病小鼠经转基因的NIPs移植后，生存时间及血糖维持正常的平均时间分别为（72．5±30．6）d和（59．1±24．0）d，较未转染的对照组（26．9±6．9）d和（12．7±3．3）d显著延长（P〈0．01）；免疫组织化学染色检测移植后不同时间（15、30、90d）的移植物组织，可见转基因细胞移植部位有完整的胰岛细胞，而对照组胰岛细胞破坏、消失，周围可见较多的炎性细胞浸润；且转基因细胞移植的小鼠血清白细胞介素2（IL-2）、γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平明显低于对照组（P〈0．05）。结论AAv介导hCTLA4-Ig基因体外转染猪胰岛细胞后再移植至受者体内，可提高受者的免疫耐受水平，延长胰岛细胞在异种受者体内的存活时间，而胰岛细胞的内分泌功能不受明显影响。     

湖南大围子猪SLA-DR基因克隆及其生物信息学分析

目的:研究湖南大围子猪SLA-DR基因特性, 评价该猪种在异种器官移植中是否具有应用前景.方法:应用RT-PCR扩增大围子猪SLA-DRA和SLA-DRB基因, 插入pUCM-T载体, 双向测序, 用NCBI中的BLAST和ExPASY软件进行生物信息学分析.结果:大围子猪SLA-DRA和SLA-DRB基因扩增片段大小分别为1 177 bp和909 bp, 均包含完整的开放阅读框, 分别编码252和266个氨基酸残基.生物信息学分析结果表明, 大围子猪SLA-DRA和SLA-DRB与人类相应的DRA、 DRB相比, 氨基酸同源性分别为82%和73%.SLA DR α链与人CD4 分子结合部位介于第124 至136 位氨基酸, 大围子猪SLA-DRA在该结合区域与人类相应的DRA存在两个氨基酸差异, 即:第127位(lle→Val), 第136位(Ser→Thr);SLA DR β链与人CD4 分子结合部位位于第134至148位氨基酸, 大围子猪SLA-DRB在该结合区域与人类相应的DRB相比氨基酸序列完全相同.与国际GenBank 已登录的许多猪种相比, SLA-DRA基因同源性高达100%, 而SLA-DRB基因在各猪种之间具有很高的多态性.结论:克隆湖南大围子猪SLA-DRA和SLA-DRB基因, 该基因与人类相应的HLA-DRA和HLA-DRB基因高度同源, 提示该猪种有望作为异种移植的候选供体.