小鼠胚胎干细胞α-GT基因打靶的研究

目的在小鼠胚胎干细胞上进行α-1,3半乳糖基转移酶(α-GT)基因打靶。方法利用长距离PCR和套式PCR从C57小鼠基因组DNA中克隆出α-GT基因组DNA片段,构建了针对α-GT基因外显子4的置换型基因打靶载体ploxp-GT,同源长臂(5．Okb),同源短臂(3．97kb),同源序列全长共约9．0kb。将打靶载体酶切线性化并以电穿孔方法转移入小鼠MEEs细胞。结果通过G418和Gancyclovir正负选择出171株ES细胞药物抗性克隆,Southern blot鉴定获得11个α-Gal( /-)小鼠ES细胞克隆,重组频率为6．4％。结论上述方法能够完成α-GT基因敲除,为进一步完成α-GT基因敲除小鼠奠定了基础。     

应用细胞工程和转基因技术治疗糖尿病:"胰岛代理细胞"的构建研究

背景由于胰岛细胞分离技术难度较大,目前糖尿病细胞移植治疗尚缺乏理想的细胞来源.目的构建具有生理性胰岛素分泌能力胰岛代理细胞系,为糖尿病基因治疗提供有效手段.设计随机对照的实验研究.地点、材料和干预本研究在第三军医大学附属新桥医院中心实验室进行.以携葡萄糖激酶(glucokinase,GK)基因的逆转录病毒及携人胰岛素原基因突变体(mutant proinsulin gene,MPIN)的逆转录病毒共同感染人肝癌细胞系HepG2细胞,G418筛选,放免法、Western-blotting及RT-PCR鉴定;挑选联合表达GK及成熟胰岛素的HepG2细胞进行葡萄糖反应性胰岛素分泌反应的检测,以单独表达成熟胰岛素的HepG2细胞作对照.主要观察指标不同葡萄糖浓度条件下,联合表达GK及成熟胰岛素的HepG2细胞培养上清中的胰岛素浓度.结果G418筛选3周获阳性细胞克隆,放免法、Western-blotting挑选出两个目的基因表达均较强的HepG2细胞1株,命名为细胞克隆"β";RT-PGR证实细胞"β"中已有两个目的基因的转录;在细胞"β"中获得葡萄糖反应性胰岛素分泌,葡萄糖浓度约1.75～2.00mmol/L时出现胰岛素分泌高峰;而在单独表达成熟胰岛素的HepG2细胞中,各种葡萄糖浓度引起的胰岛素分泌差异无显著性意义(P＞0.05).结论成功构建了具有生理性胰岛素分泌能力的"胰岛代理细胞"系.     

查菲埃立克体表面抗原P120蛋白基因的克隆与表达

查菲埃立克体 (Ｅｈｒｌｉｃｈｉａｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ)是人单核细胞埃立克体病 (ｈｕｍａｎｍｏｎｏｎ ｃｙｔｉｃｅｈｒｌｉｃｈｉｏｓｉｓ,ＨＭＥ)的病原体 ,已证实我国存在该病原。血清学分析是目前诊断ＨＭＥ及其流行病学调查的主要方法。但由于该病原体为严格胞内寄生菌 ,难以通过细胞培养制备大量抗原去满足临床ＨＭＥ的血清学诊断和流行病学调查的需要。Ｐ12 0 (相对分子质量为 12 0×10 3蛋白 )为查菲埃立克体主要表面抗原 ,具有种特异性。该蛋白基因包含了多个连续的 2 40ｂｐ重复单位 ,占全基因的 6 0 % ,并均为Ｂ淋巴细胞识…     

用查菲埃立克体P28融合蛋白作免疫印迹诊断犬埃立克体感染

目的 建立以查菲埃立克体P28融合蛋白为抗原的诊断犬埃立克体感染的免疫印迹。方法 诱导PinPoint^TMXa-3/P28重组质粒在E coli细胞内高效表达查菲埃立克体P28融全蛋白,以该重组蛋白作抗原与犬血清行免疫印迹。结果 P28融合蛋白与书籍的3份犬埃立克体感染血清呈阳性反应,与正常犬血清反应为阴性,在165份来自犬埃立克体病疫区的待检犬血清中有43份（26%）与P28反应阳性。结论 查菲埃立克体P28融合蛋白可作为犬埃立克体感染的特异性诊断抗原,以其建立的免疫印迹可用于犬埃立克体病的诊断。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶大亚单位DNA结合能力的测定

目的 检测铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶大亚单位与噬菌体基因组末端cos位点的结合能力.方法 通过PCR扩增出末端酶大亚单位编码基因tls,经pMD-T18载体克隆至表达载体pQE31上,IPTG诱导表达,获得包涵体蛋白,用包涵体裂解液溶解包涵体,通过Ni-NTA亲和层析,分离出重组目的蛋白rTLS,透析复性后,与生物素标记的基因组末端cos片段进行结合反应,通过EMSA检测DNA滞后现象.结果 成功构建了表达载体pQE-tls,获得了纯化的具有生物学活性的重组末端酶大亚单位rTLS,EMSA结果证实结合rTLS后的cos片段与无蛋白加入的对照组相比明显滞后.结论 重组噬菌体PaP3末端酶大亚单位在体外可与基因组末端cos片段发生特异性结合,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.     

慢病毒载体感染终末分化骨髓瘤细胞的研究

目的研究慢病毒载体有效转移并表达于终末分化骨髓瘤细胞。方法构建表达GFP(绿色荧光蛋白)及NeoR(新霉素抗性基因)的慢病毒载体,分别感染多发性骨髓瘤细胞J558L。采用荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP的表达,用G418筛选携NeoR慢病毒载体感染的J558L细胞。结果包装的慢病毒滴度达6×105IU/mL,对J558L细胞的感染效率为5%￣10%。通过G418筛选可得到稳定长期表达neo基因的阳性细胞克隆。结论慢病毒载体可有效感染终末分化细胞,是有发展潜力的基因治疗新载体。     

浆细胞发育基因表达谱的建立及部分基因表达的调控

目的研究浆细胞发育过程中基因表达的改变及其调控.方法应用基因芯片和RT-PCR的方法研究成熟B淋巴细胞到浆细胞发育过程中基因表达的变化.结果建立了浆细胞发育的基因表达谱,证实在浆细胞发育阶段一些重要的B细胞抗原受体(BCR)信号转导相关分子,包括Igα、Igβ、Lyn、Syk、BLNK、SWAP-70、SHP-1的表达显著下降.转录因子BSAP可能同这些分子表达的调控相关.结论在浆细胞发育阶段一些重要的BCR信号转导相关分子的表达显著下降.     

正常肺上皮细胞致瘤性转化中抑癌基因的全基因组筛选及数据库验证

目的 利用CRISPR/Cas9敲除文库在人正常肺上皮细胞致瘤性转化过程中进行全基因组筛选,以发现新的人肺癌抑癌基因,并利用临床非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)样本数据库进行初步验证.方法 构建稳定表达Cas9蛋白的人正常肺上皮BEAS-2B细胞系,在该细胞中感染含有77...     

培养学生创新能力的微生物实验教学体系实践

文章旨在探讨培养学生创新能力的微生物实验教学体系实践及效果;编写《医学微生物学实验教程》;实验课独立设置,建立了新的实验课程体系,实验内容分为基本操作技能训练、综合型、探索型和设计型实验;改革实验课教学的指导方法,建立了科学的实验教学考核方法;培养学生动手能力和科研创新能力。     

随机扩增DNA指纹分型分析耐利福平结核分支杆菌的传播

目的 对临床分离菌株进行鉴定,分析耐利福平结核分支杆菌是人群中传播。方法 采用一对随机引物（P15′－CCGGGGCGGTTC,P2,5′－CCGCCGACCGAC）,对从重庆地区肺结核病人痰标本中分离到的100株耐利福平结核发支杆菌的DNA进行随机PCR扩增,根据扩增产物的DNA电泳指纹进行分型。结果 100株耐利福平结核分枝杆菌的DNA指纹可分为6种类型,以Ⅱ、Ⅰ和Ⅲ型为主,它们分别占40％、31％和25％;这3型菌株有1／4是从初治结核病人的痰标本中分离,而地20－39岁年龄段则有1／3是从初治结核病人的痰标本中分离。结论 随机护增DNA指纹是一种简便、敏感、重复性好的菌株分型方法,可用于耐药性结核病流行监测。重庆地区结核病的流行很可能与耐利福平结核分支杆菌的传播有关。