免疫性和酒精性肝纤维化大鼠肝脏细胞质膜的蛋白质组学研究

目的 研究肝纤维化的发生机制,寻找新的与肝纤维化相关的生物学标志物. 方法将48只大鼠分为乙醇组、免疫组和对照组,分别进行乙醇灌胃、猪血清注射与等渗盐水注射处理.采用James's网状染色法染色并检测处理后第2、4、6、8周大鼠肝脏的病理学变化.将处理后第2、4、6、8周的各组大鼠分别处死4只后取肝,并将肝脏组织作匀浆处理,通过2次蔗糖密度梯度离心获得细胞质膜组分,用Western blot法检测细胞质膜的纯度.提取肝脏细胞质膜蛋白质,通过双向凝胶电泳分析各个时期的大鼠肝脏细胞质膜蛋白质,差异蛋白质点在酶解后经戴安纳升级液相色谱Ultimate 3000串联布鲁克高容量离子阱质谱HCT进行鉴定.并对被鉴定的差异蛋白质进行功能和定位的分类分析. 结果大鼠肝脏细胞质膜得到了有效富集.双向凝胶电泳分析第2周和第8周的大鼠肝细胞质膜蛋白质,共找到87个差异蛋白质点,这些蛋白质点经过质谱鉴定后对应于30个非冗余蛋白质,包括膜联蛋白A2,细胞支架角蛋白8和18. 结论膜联蛋白A2、细胞支架角蛋白8和18等蛋白质可成为肝纤维化诊断的新标志物.     

siRNA诱导K562细胞凋亡的实验研究

目的　构建抗bcr/ablmRNA的小干扰RNA(smallinterferenceRNA ,siRNA)表达载体 ,转染K5 6 2细胞 ,检测诱导细胞凋亡的变化。方法参照siRNA模板设计原则 ,设计并合成两条siRNA模板序列 ,将其插入质粒pSilencer1.0 U6中得到重组子pBCR6 ,通过限制性酶切和测序鉴定 ,大量制备、纯化 ;以X tremeGENEQ2介导瞬时转染K5 6 2细胞 ,设置空载体作为对照。在转染后不同时间 ,利用原位缺口末端标记法 (TUNEL)、膜联蛋白Ⅴ 碘化丙锭染色法 (AnnexinⅤ /PI)通过流式细胞仪检测K5 6 2细胞凋亡的变化。结果针对bcr/ablmRNA融合区域设计的siRNA模板序列 ,经筛选合成寡核苷酸链后退火形成双链 ,再插入pSilencer1.0 U6 ,经酶切和测序鉴定提示构建成功 ;大量制备、纯化后进行转染 ,在转染后 4 8,72hTUNEL法检测和AnnexinⅤ /PI染色法均显示抗bcr/ablmRNA的siRNA表达载体可有效诱导K5 6 2细胞凋亡 ,且随转染时间的延长凋亡率增高 [转染pBCR6 72h的K5 6 2细胞凋亡率为 (47.80± 1.6 3) % ],与对照组 [(6 .6 7± 0 .37) % ]比较差异有显著性 (P <0 .0 0 0 1)。结论抗bcr/ablmRNA的siRNA表达载体构建成功 ,初步结果显示它可以有效地诱导K5 6 2细胞发生凋亡 ,预期siRNA有望成为慢性髓系白血病分子靶向治疗的一个新工具。     

胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸对慢性支气管哮喘小鼠气道重塑的影响

目的研究含非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)能否预防或减轻慢性支气管哮喘(简称哮喘)小鼠气道重塑的发生。方法 40只雌性清洁级 C57BL/6小鼠按随机数字表法分为4组,每组10只。(1)慢性哮喘组(A 组):分别于第1、14天小鼠腹腔注射1 ml致敏液[卵蛋白(OVA,10 μg)+氢氧化铝凝胶(100 μg)];从第21天开始雾化吸入2.5%OVA 溶液,每次30 min,每周3次,连续8周。(2)CpG-ODN 干预组(B 组):在 OVA 致敏的同时给予浓度为60μg/ml 的 CpG-ODN 腹腔注射1 ml 共2次,以后每2周腹腔注射1次共4次。(3)GpC-ODN 对照组(C组):将 CpG 替换为鸟嘌呤-磷酸-胞嘧啶(GpC,剂量及用法同 CpG-ODN)作为对照。(4)生理盐水(NS)对照组(D 组):给予 NS 进行致敏(每次1 ml 腹腔注射)和激发(用 NS 雾化吸入)。在末次激发24 h 后所有小鼠取血测嗜酸粒细胞(EOS)数和血清 IgE;收集支气管肺泡灌洗液(BALF)做细胞分类计数,用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测上清液中白细胞介素13(IL-13)和转化生长因子β_1(TGF-β_1)的浓度。取左肺组织行苏木精-伊红(HE)染色和 Masson 三色染色,用抗α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体和抗 TGF-β_1抗体行免疫组化染色。结果 A 组外周血 EOS 计数为(89±10)×10~4/ml、血清 IgE 为(279±53)ng/ml,BALF 中 EOS 计数和分类分别为(6.30±1.30)×10~5/ml、0.181±0.030,A 组 IL-13浓度为(4 015±361)pg/ml、TGF-β_1浓度为(356±64)pg/ml,以上数值与 D 组比较差异有统计学意义(t 值分别为24.0、15.7、14.7、18.4、12.0和18.9,P 均<0.01);A 组 Masson 三色染色、α-SMA、TGF-β_1阳性染色面积百分比[分别为(29.7±4.2)%、(45±7)%、(34±4)%]与 D 组比较差异也有统计学意义(t 值分别为18.0、15.6和17.9,P 均<0.01)。应用 CpG-ODN 干预后(B组)的 Masson 三色染色、α-SMA、TGF-β_1阳性染色面积百分比[分别为(13.8±3.2)%、(25±3)%、(18±4)%]与 A 组比较差异也有统计学意义(t 值分别为9.5、8.9、9.8,P 均<0.05)。结论应用CpG-ODN 干预慢性哮喘模型,不仅能抑制 Th2细胞反应和 EOS 肺浸润,还能抑制气道重塑的发生和发展,它可能是通过抑制 TGF-β_1、IL-13等因子而抑制气道重塑的。     

干扰素和核苷(酸)类似物治疗对HBV cccDNA的影响与慢性乙型肝炎的功能性治愈

目前临床治疗慢性乙型肝炎的药物主要包括干扰素和核苷(酸)类似物两大类,但均无法有效清除病毒和治愈乙型肝炎。HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)作为HBV转录复制的模板,以微小染色体形式持续存在于细胞核内,被认为是HBV慢性感染和难以治愈的关键核心。鉴于cccDNA很难被彻底清除,近年来以cccDNA持续沉默为基础的慢性乙型肝炎功能性治愈已成为临床和基础研究的主要目标。从现有治疗手段对cccDNA的影响切入,介绍当前对cccDNA含量和活性受控因素的认知,探讨cccDNA池难以清除的关键特性环节,在此基础上展望功能性治愈慢性乙型肝炎目标下研究cccDNA的重点。     

某院临床科室中层干部科研绩效考核探讨

目的 评价临床科室中层干部的科研绩效.方法 建立科研绩效考核方案,以课题、论文、成果、专利为评分指标,计算临床科室科研实绩总分,加权量化为标准分,完成中层干部科研绩效考核.结果 上海市公共卫生临床中心研究探讨的科研绩效评估方法较好地完成了临床科室中层干部的科研绩效考核工作.各科室临床科研实绩差距较大,科研成果分布不均衡,医院可采取措施针对性改进.上述方法具有客观性、合理性和可比性.     

CpG ODN 对活动性肺结核患者外周血Th1/Th2型免疫应答的调节作用

目的 观察CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODN）对活动性肺结核患者外周血单个核细胞（PBMC）γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-12以及IL-10表达的影响.方法 20例活动性肺结核患者和20名健康人PBMC根据刺激物不同分为空白对照组、结核菌素纯化蛋白衍化物（PPD）组（10 ng/mL）、CpG ODN组（2 nmoL/mL）和CpG ODN＋PPD组.用real time-PCR法检测PBMC IFN-γmRNA、IL-12 mRNA和IL-10 mRNA的表达.结果 ①活动性肺结核患者PBMC空白对照组IFN-γ mRNA和IL-12 mRNA的表达低于健康人（P＜0.01,P＜0.05）,IL-10 mRNA的表达与健康人相似（P＞0.05）;②经PPD刺激,IFN-γ mRNA、IL-12 mRNA和IL-10mRNA的表达较空白对照组增高（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）,但IFN-γ mRNA的表达低于健康人（P＜0.01）,IL-12 mRNA的表达与健康人相似（P＞0.05）,IL-10 mRNA的表达高于健康人（P＜0.01）;③经CpGODN刺激,IFN-γmRNA和IL-12 mRNA的表达高于空白对照组（P＜0.01,P＜0.01）,但低于健康人（P＜0.01,P＜0.05）,IL-10 mRNA的表达与空白对照组相似（P＞0.05）,与健康人也无差别（P＞0.05）;④经CpGODN＋PPD刺激,IFN-γ mRNA和IL-12 mRNA的表达较空白对照组增高（P＜0.01,P＜0.01）,但IFN-γ mR-NA的表达低于健康人（P＜0.01）,IL-12 mRNA的表达与健康人相似（P＞0.05）,IL-10 mRNA的表达与空白对照组相似（P＞0.05）,与健康人也无差别（P＞0.05）;⑤经CpGODN＋PPD刺激,肺结核患者IL-12 mRNA的表达高于PPD组（P＜0.05）,IL-10mRNA的表达低于PPD组（P＜0.01）.结论 CpGODN可促进活动性肺结核患者PBMC产生IFN-γ和IL-12,增强Th1型免疫反应.CpGODN与PPD联合应用可进一步促进PPD对IL-12表达的诱导,并抑制PPD对IL-10表达的增强作用.     

白细胞介素-4,-13促进人肺成纤维细胞ADAM33基因的表达

研究发现ADAM33基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）与哮喘的发生以及气道高反应性有显著相关。ADAM33基因主要在肺的平滑肌细胞、成肌纤维细胞和成纤维细胞表达，而在上皮细胞、T细胞或免疫细胞中表达较少。由于ADAM33基因在肺间充质细胞的选择性表达，因此，ADAM33基因可能与小气道重塑有关。IL4和IL-13都是Th2型细胞因子，在哮喘的慢性气道炎症中起重要作用。最近研究发现IL4和IL-13可以通过增加支气管上皮细胞对转化生长因子-β的释放，从而促进气道重塑。因此，我们研究IL-4和IL-13对人肺成纤维细胞ADAM33基因表达的影响，探讨ADAM33基因表达异常在哮喘气道重塑中的作用。     

Ⅰ型嗜肺军团菌杂交瘤细胞株的建立和鉴定

用Ⅰ型嗜肺军团菌(Ⅰ型LDB)颗粒生抗原免疫的BALB／C小鼠脾细胞与小鼠骨髓癌SP2／0细胞在PEG怍用下融合，经二次克隆化后建立了一株分泌抗Ⅰ型LDB单克隆抗体的细胞株(No．19 McAb)。经ELISA、间接血凝试验、双向琼脂扩散试验、结合力试验，染色体检查及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测，证实此杂交瘤所分泌的McAb属小鼠IgG类，对Ⅰ型LDB是特异的。No．19 McAb将有助于Ⅰ型LDB的检测及其亚型的分析与流行病学调查．     

hCGβ在乳酸杆菌中的分泌性表达

目的 :探索乳酸杆菌携带表达 h CGβ避孕疫苗的抗生育作用。方法 :用 PCR从短小乳酸杆菌染色体中扩增得到 S-层蛋白的信号肽序列 ,将其与 h CGβ基因连接后克隆到乳酸杆菌整合型表达载体 p Ilac的 lac启动子下游 ,得到质粒 p Ilac h CGβ,电穿孔转化干酪氏乳酸杆菌 Lb. caseiCECT5 2 76。挑选转化后的耐药菌落 ,在含红霉素培养基中培养 ,抽提其染色体 DNA,PCR及测序鉴定证实 h CGβ基因整合到 Lb.casei的基因组中。h CG放免检测上清及细胞裂解液中的 h CGβ。结果 :h CGβ基因已经整合到 Lb.casei的基因组中 ;细菌产生的目的蛋白约有 3/ 4分泌进入培养上清 ,而加入诱导剂乳糖 2 1 h后 ,上清中的蛋白浓度达到峰值 ,为 440 m IU/ m L。重组菌在无选择压力条件下培养 5 0代后仍可分泌 h CGβ。结论 :h CGβ在乳酸杆菌中得到了稳定的、分泌性的表达     

中国人丙型肝炎病毒基因组3‘端非编码区的研究

目的 分析中国丙型肝炎病人ＨＣＶ基因组３‘端非编码区,以促进对ＨＣＶ基因组复制机制的研究。方法 采用两种方法,从上海地区感染ＨＣＶ的病人血清中,扩增获得ＨＣＶ基因组３’端非编码区：一是用套式ＰＣＲ直接的增,二是先分别ＨＣＶ３‘ＮＣＲ的前半部分和后半部分,再将两片段进行融合ＰＣＲ。ＰＣＲ产物进行测序后作同源性分析。