血清MMP9蛋白ELISA检测方法的建立及在肝癌患者血清检测中的初步应用

目的建立基质金属蛋白酶9（MMP9）的双抗体夹心ELISA检测方法，探讨血清中MMP9在正常人及肝癌患者中的差异。方法从人肝组织中经过反转录扩增出MMP9基因721—1156bp区段，插入到原核表达质粒pQE30中，在大肠埃希菌M15中诱导蛋白表达。以纯化的融合蛋白HIS—MMP9为抗原免疫实验用兔及豚鼠，得到的MMP9抗血清经过纯化后，建立双抗体夹心ELISA法。对227份正常及193份肝癌患者血清中的MMP9进行检测。结果SDS—PAGE显示所表达的HIS—MMP9融合蛋白相对分子质量约为17000；以原核表达蛋白为抗原制备的MMP9抗血清可有效地识别重组MMP9和中性粒细胞和HepG2细胞内源性MMP9蛋白；利用建立的MMP9 ELISA检测技术发现肝细胞癌患者血清中MMP9的含量高于正常人群，差异具有统计学意义，P〈0．001。结论建立的双抗体夹心ELISA方法可用于血清MMP9的检测，为建立以MMP9为检测指标的肝细胞癌患者转移复发筛查方法提供了科学基础。     

PrP可抑制tau介导的体外微管形成作用

目的研究朊蛋白（PrP）对微管相关蛋白（tau）介导的体外微管形成的影响。方法我们从兔脑组织中纯化出微管蛋白，并纯化出原核表达的tau和PrP蛋白。利用电子显微镜技术显示微管蛋白的聚集、tau对微管蛋白的聚集的影响，及PrP对tau介导的微管蛋白形成微管的影响。通过GST pull down实验研究tau与微管蛋白的相互作用，PrP对tau与微管蛋白相互作用的影响。结果电子显微镜负染显示纯化的微管蛋白在一定的实验条件下可聚集形成直径为25Nm的微管结构。在反应体系中加入tau后微管样结构的形成明显增加，而加入PrP后可显著地抑制tau对微管结构形成的促进作用。重组tau能与提取的天然微管蛋白在体外结合，而PrP可明显地抑制tau与微管蛋白的结合作用，并呈现剂量依赖关系。结论tau蛋白可促进微管蛋白形成微管结构，而PrP可通过与tau的相互作用抑制微管的形成。     

我国人朊病毒病病例特征分析及朊病毒病发病机制的研究进展

<正>可传播性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies,TSE)是一类侵袭人类及多种动物中枢神经系统的退行性脑病,潜伏期长,100%致死率,并可在同种动物间传播。典型的神经病理学改变为脑组织中出现海绵状空泡样变性、淀粉样斑块沉积、神经元丢失和胶质细胞增生^[1]。     

羊瘙痒病小鼠适应株ME7可突破种属屏障颅内感染金黄地鼠

目的　羊瘙痒病感染因子在哺乳动物种属间的传播认为受种属屏障的限制 ,研究羊瘙痒病小鼠适应株ME7在仓鼠中的发病特征。方法　ME7毒株颅内接种至金黄地鼠 ,观测疾病发生的潜伏期、临床病程和主要症状 ;Westernblot和电子显微镜动态观测脑组织中PrPSc和痒病相关纤维的出现和分子特征。结果　与以往报道的金黄地鼠适应株 2 6 3K和小鼠适应株 139A不同 ,在接种后 4 6 0～ 5 30d后 ,感染动物出现明显的症状 ,主要为消瘦、嗜睡、运动迟缓 ;感染动物脑组织中存在有羊瘙痒病相关纤维和PrP -res;羊瘙痒病相关纤维和PrP -res的出现明显早于临床发病 ;比较三种毒株在仓鼠和小鼠脑组织中出现的PrP -res发现虽然在电泳移动位置上无差异 ,但ME7和 139A的无糖分子比例明显降低。结论　小鼠适应株ME7可突破种属屏障感染金黄地鼠 ;不同毒株在潜伏期、主要临床症状和临床病程等方面有明显差异 ;PrP -res的形成不仅受接种毒株的影响 ,而且受宿主PrP分子特征的影响     

羊瘙痒因子263K经多种途径感染仓鼠的脑外组织PrP~(Sc)分子和沉积特点研究

目的　比较研究实验仓鼠经不同途径感染羊瘙痒病 (Scrapie)毒株 2 6 3K的终末期病鼠脑外组织内PrPSc分子和沉积特点。方法　以Scrapie 2 6 3K毒株经颅内、腹腔、心内、肌肉注射及灌胃等途径接种金黄地鼠 ,在终末期取脑、脊髓、脾、肾、舌、肌肉、小肠回盲部和胃组织 ,用HE染色观察病理变化 ,免疫组化法检测PrPSc的组织沉积特点 ,Westernblot检测PrPSc分子特征。结果　五种感染方式均可引起动物发病 ,在脑和脊髓组织中观察到典型的病理改变 ;PrPSc免疫组化检测显示外周途径感染动物脊髓白质内有大量沿纤维走行的PrPSc沉积 ,灰质前后角内围绕空泡点状或网状沉积 ,而颅内感染主要在中央管附近和后角出现大量的点状PrPSc沉积 ;脾脏、肾、小肠回盲部、胃组织中均观察到点状PrPSc的沉积 ;WesternBlot检测发现不同感染途径动物脊髓提取物均出现可抵抗蛋白酶消化的PrPSc条带 ,与脑提取物中PrPSc电泳性状完全一致 ;外周组织仅在脾脏检测到抵抗蛋白酶消化的PrPSc,但与正常对照比较 ,各种组织中PrP的总量明显增高 ,同时呈现与中枢神经组织不同的PrP电泳特征。结论　在TSE感染发病过程中 ,多种组织细胞成分可能参与了TSE感染因子的向中枢神经系统传递过程 ,PrP蛋白在中枢神经组织和其他外周组织细胞中的翻译后修饰及     

顶空毛细管气相色谱法测定尼麦角林中7种有机溶剂的残留量

目的:建立尼麦角林中7种有机溶剂残留量的测定方法。方法:采用顶空毛细管气相色谱法,HP-5柱(30 m×0.53mm×5μm),氢火焰离子化检测器(FID),以二甲亚砜为溶剂,初始柱温为50℃(3 min),然后以每分钟5℃升至85℃,再以每分钟10℃升至175℃;进样口温度120℃,检测器温度220℃。结果:7种残留有机溶剂甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、二氯甲烷、三乙胺和甲苯均达到了完全分离,且3批样品中有机溶剂的残留量均符合规定。结论:经方法学验证,该方法灵敏度、准确度均达到有机溶剂残留量的检测要求,可用于原料药尼麦角林中7种残留溶剂的同时检测。     

Interaction between various 14-3-3β segments and PrP In Vitro

Objective To study the potential interaction between PrP protein.Methods The supernatant of health and scrapie-infected hamsters' brain homogenate was prepared,while various recombinant 14-3-3β or PrP proteins were purified.The possible molecular interaction between 14-3-3β proteins and PrP was tested by pull-down and immunoprecipitation assays.Results Both native PrPc and its protease-resistant isoform(PrPsc)formed complexes with 14-3-3β.The full-length recombinant 14-3-3β proteins interacted with PrP.The domain responsible for interacting 14-3-3β was located at N-terminal of 14-3-3β(residues 1 to 38).Conclusion The studies of the association of PrP with 14-3-3β may further provide insight into a potential role of 14-3-3β in the biological function of PrP and the pathogenesis of prion disease.     

膜蛋白Flotillin-1与细胞膜PrPC内吞相关性研究

目的 研究膜蛋白Flotillin-1是否与PrPC蛋白内吞相关.方法 利用免疫印迹法观察不同细胞株中Flotillin-1表达情况；利用免疫共沉淀的方法,检测Flotillin-1和PrPC蛋白在Cu2+存在条件下相互作用的情况.结果 ①免疫印迹法显示Flotillin-1在多种细胞株中均有表达,且表达量没有明显差别；②免疫共沉淀实验(IP)结果提示在Cu2+处理条件下细胞中有PrPC与Flotillin-1蛋白复合体的形成,并且与Cu2+浓度以及Cu2+处理时间相关；结论 膜蛋白Flotillin-1与细胞膜PrPC内吞过程存在相关性.     

叉头蛋白O1在黄连素抗人肺腺癌A549细胞中作用机制研究

目的探讨黄连素(BBR)抗肺腺癌A549细胞及叉头蛋白O1(FKHR)在其中的作用机制。方法实验分为对照组、BBR 25μM组、BBR 50μM组、BBR 75μM组,分别检测各组A549细胞活性、凋亡率以及FKHR和凋亡相关蛋白含量的变化。FKHR siRNA特异性抑制FKHR表达后,BBR(0、50μM)处理细胞24 h,重复上述检测。构建裸鼠移植瘤模型,腹腔注射BBR(10 mg/kg、20 mg/kg),对照组注射等体积磷酸盐缓冲液(PBS)。检测细胞活力和细胞凋亡率,Western-blot检测FKHR及凋亡相关蛋白的表达。结果 BBR有效降低A549细胞活力并促进细胞凋亡(P0.05);Western-blot检测结果显示BBR上调FKHR和Bax的含量(P0.05),抑制Bcl2的表达(P0.05);FKHR siRNA转染显著抑制其表达,同时抑制BBR抗肺腺癌作用(P0.05)。结论黄连素可有效抑制肺腺癌A549细胞增殖、促进细胞凋亡,此作用可能与激活FKHR有关。