丹酚酸B体外诱导MSCs向心肌细胞分化中β-catenin表达的实验研究

【目的】体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌细胞分化,检测分化过程中p—catenin蛋白表达的变化。【方法】大鼠MSCs经采用密度梯度离心法和贴壁筛选法培养,免疫细胞化学法检测MSCs的表面抗原表达,取纯化稳定的P3代MSCs,将其分为4组：空白对照组、5-氮胞苷组、丹酚酸B组、5-氮胞苷联合丹酚酸B组、进行诱导,诱导4周,观察细胞形态学改变;免疫组化方法检测心肌特异性蛋白cTnT的表达,逆转录——聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测MSCs诱导前后糖原合成激酶（GSK）、B—catenin基因mRNA表达。【结果】诱导分化后的各组不同程度的阳性表达心肌细胞特异性蛋白心肌肌钙蛋白T（cTnT）,RT-PCR显示诱导组GSK基因表达上调,B—catenin基因表达下调。【结论】丹酚酸B促进MSCs向心肌细胞分化,并伴有wnt经典信号通路的抑制。     

银杏内酯B对高胆固醇诱导的PC12细胞胆固醇含量的影响

目的: 基于体外血脑屏障环境下观察银杏内酯B(ginkgolide B,GB)对高胆固醇诱导PC12细胞胆固醇含量的影响。方法: 利用Transwell共培养脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞建立体外血脑屏障,并与PC12细胞共培养。在Transwell内皮细胞侧添加40 μmol/L胆固醇,并选择不同浓度银杏内酯B分别干预上述模型。观察PC12细胞的形态学变化,通过MTT法筛选银杏内酯B的干预浓度,用HPLC法检测PC12细胞内胆固醇含量的变化。结果: 倒置相差显微镜观察发现PC12细胞大多呈圆形、短梭形或三角形,胞浆伸展,细胞两极有短突起,细胞折光性好,胞核可见。通过MTT确定的银杏内酯B干预剂量分别为低剂量1 μmol/L、中剂量5 μmol/L和高剂量25 μmol/L。HPLC法检测显示模型组PC12细胞内胆固醇含量升高,与对照组相比差异显著 (P<0.01)。银杏内酯B干预上述模型16 h后,25 μmol/L GB降胆固醇的效果最佳,与模型组相比差异显著(P<0.05),25 μmol/L GB与阳性对照药辛伐他汀相比差异无显著(P>0.05)。结论: 中药银杏叶有效单体GB可以降低体外血脑屏障环境下PC12细胞内胆固醇含量。     

痰浊内阻及心气虚弱型冠心病患者的比较蛋白质组学研究

目前,从系统生物学的视角认识中医辨证分型的物质基础和科学内涵,利用高通量的基因组学、蛋白质组学、代谢组学等系统生物学技术,为中医证候本质的研究提供新的技术平台支持,对于中医药现代化研究     

TIMP-3甲基化调控与大肠癌转移的关系研究

目的探讨TIMP-3基因启动子5’CpG岛甲基化状况与大肠癌转移的关系。方法随机收集45例大肠癌病例。用甲基化特异性PCR检测TIMP-3基因启动子5’CpG岛甲基化状况;用免疫组化方法检测TIMP-3蛋白的表达水平;分析TIMP-3基因启动子甲基化与大肠癌转移之间的关系。结果大肠癌肝转移组、淋巴结转移组TIMP-3基因甲基化率分别高于非肝转移组（P〈0．01）、非淋巴结转移组（P〈0．01）;Duck＇s C＋D组甲基化率高于Duck’s A＋B组。大肠癌TIMP-3基因甲基化与TIMP-3蛋白的表达缺失有关（P〈0．01）。结论TIMP-3甲基化是大肠癌中TIMP-3蛋白表达缺失的主要原因,在大肠癌转移中发挥重要的作用,提示预后不良。     

基于TGF-β1/Smad4信号探讨缺氧条件下补阳还五汤促进新生血管成熟的机制

目的:研究在缺氧条件下补阳还五汤通过调控转化生长因子-β_1(transforming growth factor-β_1,TGF-β_1)/Smad蛋白4(drosophila mothers against decapentaplegic protein,Smad4)基因信号促进新生血管成熟的分子机制。方法:于体外鼠尾胶基质上种植胸主动脉血管段构建新生血管三维培养模型,随机分为正常组,缺氧模型组,辛伐他汀组,补阳还五汤组。缺氧模型组,常氧条件下培养5 d后缺氧24 h,药物治疗组在缺氧同时分别给予辛伐他汀(10μg·L~(-1))和补阳还五汤载药血清(10%),正常组则常氧条件下培养6 d。利用倒置显微镜观察新生血管生长情况,利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测新生血管培养液中TGF-β_1的含量,利用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测新生血管TGF-β_1和Smad4 mRNA的表达,利用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测新生血管神经型钙黏蛋白(neural-Cadherin,NCadherin)蛋白表达。结果:各实验组结果显示,培养6 d,倒置显微镜下均可观察到新生血管生成,与正常组比较,模型组中存活的新生血管数量减少(P0.05),给予补阳还五汤干预后存活的新生血管数量增多(P0.05);ELISA结果显示与正常组比较,缺氧模型组TGF-β_1含量明显降低(P0.01),给予补阳还五汤干预后TGF-β_1含量升高(P0.05);Real-time PCR结果显示,与正常组比较,模型组TGF-β_1和Smad4 mRNA表达下调(P0.05),经补阳还五汤治疗后TGF-β_1和Smad4 mRNA表达明显上调(P0.05);Western blot结果显示与正常组比较,模型组N-Cadherin蛋白表达下调(p0.05),补阳还五汤干预后NCadherin蛋白表达上调(P0.05)。结论:在缺氧条件下补阳还五汤促进成熟新生血管形成,其机制与激活TGF-β_1/Smad4信号进而启动下游N-Cadherin蛋白合成,形成细胞间紧密连接有关。     

丹酚酸B对AGEs诱导高脂内皮细胞凋亡的保护作用

目的：探讨丹酚酸B对糖基化终末产物（AGEs）诱导高脂内皮细胞凋亡的保护作用。方法：以AGEs和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）联合作用诱导人脐静脉内皮细胞凋亡,通过hochest 33258染色,观察不同浓度丹酚酸B（10-4、2×10^-4mol/L）作用不同时间（12、24、36、48、72h）,对内皮细胞凋亡的影响。结果：研究表明丹酚酸B能够明显抑制AGEs诱导高脂内皮细胞凋亡,并有一定剂量效应性和时间效应性。结论：提示丹酚酸B对防治糖尿病合并动脉粥样硬化具有一定作用。     

丹酚酸B预处理EPCs对AMI大鼠移植骨髓间充质干细胞后心肌微环境的影响

[目的]探讨中药丹酚酸B预处理的内皮祖细胞(EPCs)对急性心肌梗死(AMI)大鼠移植骨髓间充质干细胞(BMSCs)后心肌微环境的影响。[方法]56只AM I模型大鼠随机分为假手术组、模型组、BM SCs组、EPCs+BM SCs组,其中治疗组用丹酚酸B最佳药物浓度处理的EPCs与BM SCs混合,在大鼠AM I区周边分5点注射。免疫荧光和免疫组化方法检测AM I大鼠梗死区心肌收缩蛋白α型肌球蛋白重链(α-MHC)和I型胶原蛋白的表达。[结果]细胞移植4周后,各细胞联合移植组中,2:14、:1和8:1组在Brdu集中表达区域均有不同强弱程度的α-MHC阳性表达,除假手术组较少外,所有接受冠状动脉结扎的大鼠心肌梗死区I型胶原表达均升高。[结论]BMSCs在丹酚酸B预处理的EPCs干预的心肌微环境下可向心肌细胞分化,可预防或改善心室重塑的发生。     

疏肝活血方对体外培养主动脉平滑肌细胞影响的实验研究

疏肝活血方对体外培养主动脉平滑肌细胞影响的实验研究范英昌，胡利民，陆融（天津中医学院）动脉粥样梗化（Ａｓ）是当今社会发病率最高、危害最大的疾病之一。多年来，人们对Ａｓ的病因病理从多方面进行了深入研究，以期揭示其病因病理，从而寻找出有效的防治手段。平滑...     

丹酚酸B对离体培养内皮祖细胞VEGF、bFGF mRNA表达及抗氧化酶活性的影响

目的 探讨中药单体丹酚酸B对离体培养内皮祖细胞(EPCs)细胞因子mRNA表达及抗氧化酶活性的影响.方法 密度梯度离心法和贴壁筛选法培养、纯化EPCs,免疫细胞化学法鉴定.选择丹酚酸B最佳药物浓度干预的EPCs,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测细胞VEGF,bFGF mRNA表达,测定细胞培养液抗氧化酶SOD,GSH-Px的活性.结果 丹酚酸B组VEGF,bFGF mRNA的表达量增加,与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05).丹酚酸B组细胞培养液中SOD活性增强,与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05);GSH-Px活性有增强趋势,但与对照组比较差异无显著性(P＞0.05).结论 丹酚酸B对EPCs具有保护作用,增强其细胞功能的部分机制与其增强分泌细胞因子VEGF和bFGF mRNA的表达,并且促进细胞释放SOD、GSH-Px,清除自由基能力增强有关.     

骨髓间充质干细胞与丹酚酸B预处理内皮祖细胞共移植对急性心肌梗死大鼠心功能及分化基因表达的影响

背景:由于心肌细胞自身增殖能力有限,急性心肌梗死后细胞移植是目前流行的再生心肌方法.骨髓间充质干细胞的存活受心肌微环境的影响,而内皮祖细胞参与血管新生,可为骨髓间充质干细胞提供微环境. 目的:探讨骨髓间充质干细胞联合中药丹酚酸B预处理的内皮祖细胞共移植后,对急性心肌梗死大鼠心功能改善及骨髓间充质干细胞分化早期基因表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-01/2008-03在天津中医药大学完成.材料:清洁级雄性Wistar大鼠45只,由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供.丹酚酸B为天津天士力现代中药资源有限公司产品,批号 20060601.方法:分别取2只和1只大鼠,采用密度梯度离心法+贴壁筛选法分离培养纯化内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞.剩余42只大鼠随机分为4组:假手术组9只、模型组11只、骨髓间充质干细胞组12只、共移植组10只.假手术组只开胸穿线,不结扎左冠状动脉;其余3组结扎左冠状动脉建立心肌梗死模型.结扎冠状动脉15 min后再次开胸,共移植组吸取骨髓间充质干细胞悬液250 μL(浓度1×1010L-1)+8mg/L丹酚酸B预处理的内皮祖细胞悬液250 μL(浓度1×108L-1),于结扎区附近心肌组织分5点注射:骨髓间充质干细胞组同法注射单纯骨髓间充质干细胞悬液500μL,模型组注射等量细胞培养液.主要观察指标:采用超声心动仪测定左室功能,Real-time PCR检测心肌分化基因Nkx2.5,GATA-4的表达.结果:细胞移植4周后与模型组比较,骨髓间充质干细胞组左室结构有改善趋势,但差异无显著性意义(P>0.05);共移植组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、舒张末期室间隔厚度、收缩末期室间隔厚度均明显改善(P＜0.05),心室收缩功能指标射血分数、心输出量均明显改善(P<0.05).细胞移植4周后与模型组比较,骨髓间充质干细胞组、共移植组Nkx2.5及GATA-4 mRNA表达均明显增加,且共移植组Nkx2.5 mRNA增加幅度明显大于骨髓间充质干细胞组(P<0.05).结论:骨髓间充质干细胞联合丹酚酸B预处理的内皮祖细胞共移植方式,可上调骨髓间充质干细胞向心肌分化过程中Nkx2.5,GATA-4基因的表达,改善急性心肌梗死大鼠心室结构,增强心功能.