IL-2和IL-12联合基因治疗小鼠肝癌的实验研究

目的探讨瘤内注射共表达mIL-12和hIL-2质粒DNA抗小鼠肝癌皮下移植瘤的作用.方法构建pDC511hIL2-mIL12、pDC511mIL-12、pDC511hIL-2真核表达质粒载体;ELISA方法检测各组质粒在真核细胞的表达;小鼠肝癌H22皮下移植瘤瘤内注射各组质粒DNA后,检测不同时间血清中细胞因子浓度;观察各组小鼠存活时间,肿瘤大小变化;并检测各组小鼠脾脏细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)活性.对各治疗组在质粒DNA注射后一月进行瘤体组织学观察.结果酶切鉴定各组质粒载体,均示构建成功,并能在真核细胞内高效表达相应细胞因子.瘤内注射各组质粒载体后,pDChIL2-mIL12组在不同时间表达的hIL2和mIL12分别与pDC511hIL2 组(F=71.11,P<0.01)、pDC511mIL12组 (F=30.70,P<0.05)比较有显著性差异.mIL-12基因和hIL-2基因联合治疗组,肿瘤生长明显受抑制,疗效显著优于各单独治疗组和对照组(P<0.05),并且小鼠脾细胞CTL杀伤活性增强.双基因联合治疗组,病灶内肿瘤细胞坏死明显,炎性细胞广泛浸润.结论 IL-12、IL-2基因治疗可抑制小鼠肝癌H22皮下移植瘤的生长,提高机体的抗肿瘤免疫应答,两者联合运用可产生协同效应.为进一步运用高效基因导入技术进行肝癌基因治疗研究提供初步的实验依据.     

靶向HBVX基因的shRNA表达质粒对HBV复制的抑制作用

目的 观察靶向HBVX基因的RNA干扰(RNAi)对HBV复制的抑制作用.方法 选择HBV基因组X区的Nt1681-1708作为靶序列,合成相应的正、反义寡核苷酸,退火后形成双链,克隆入shRNA表达质粒,将得到的质粒与HBV质粒共转染HepG2细胞,观察HepG2细胞中HBsAg、HBeAg、HBV DNA和pgRNA的受抑制情况.结果 HBsAg、HBeAg的表达、HBV DNA和pgRNA的拷贝数均明显受到抑制.结论 所选靶区通过RNAi可有效抑制HBV复制.     

白细胞介素-12治疗小鼠肝癌的实验研究

白细胞介素(IL)-12能诱导T细胞和自然杀伤细胞(NK)细胞产生多种细胞因子，促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)增殖和功能的活化。本实验以瘤内注射表达mIL-12质粒DNA的方式，初步探讨IL-12基因治疗肝癌的作用。     

基因重组HBV的构建及其表达反义RNA抗-HBV作用的研究

目的　探索利用乙型肝炎病毒 (HBV)作为基因治疗载体的可能性及检验其表达反义RNA抗HBV的作用。方法　在表达完整HBV颗粒的质粒上 ,经基因修饰后分别表达S或S启动子区的反义RNA ,整合于具有HBV复制的 2 .2 .15细胞 ,形成细胞克隆 ,酶联免疫吸附 (ELISA)法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg ,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBVDNA ,聚合酶链反应(PCR)法检测上清液中重组HBV颗粒。结果　 2 .2 .15 pMEP4组、2 .2 .15 SAS组和 2 .2 .15 PAS组对HBsAg平均抑制率分别为 (2 .74± 3.83) %、(6 6 .5 4± 4 .4 5 ) % (P <0 .0 1)和 (5 5 .18± 3.2 7) % (P <0 .0 1) ;对HBeAg平均抑制率分别为 (4 .4 6± 4 .2 5 ) %、(2 6 .36± 1.6 9) % (P <0 .0 1)和 (6 5 .5 4± 3.2 2 ) % (P <0 .0 1) ;对HBV复制的抑制率分别为 17.0 %、5 9.9%和 72 .8%。 2 .2 .15 SAS组及 2 .2 .15 PAS组培养上清液中能检测出突变型HBV颗粒。结论　经过对HBV基因组的两处改造 ,分别在细胞内表达S区及S启动子区反义RNA具有干扰HBV复制及抑制HBV抗原表达的作用 ;在 2 .2 .15细胞中野生型HBV辅助下 ,仍能包装并分泌完整的HBV样颗粒     

乙型肝炎病毒载量与干扰素治疗效果的相关性研究

乙型肝炎病毒 (HBV)感染时 ,外周血中HBVDNA是病毒复制活动最直接和可靠的标志 ,因此在临床实践中监测患者外周血中病毒核酸的动态变化 ,对感染转归、病情和预后的判断 ,以及药物疗效评价均具有重要价值。实时荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)是近年出现的核酸定量新方法 ,具有敏感性高、重复性好、特异性强和定量范围宽等突出优点[1,2 ] 。本文应用该方法检测了 71例慢性乙型肝炎患者干扰素治疗前后血清中的HBVDNA含量 ,并与相关因素和免疫学指标相比较 ,以探讨病毒载量与干扰素治疗之间的关系。材料与方法一 .病例所有慢性乙型肝炎…     

丙肝病毒（HCV）及乙肝病毒（HBV）双表达栽体的构建及表达

目的：为探索HCV/HBV高效联合基因免疫策略，构建具有2套独立表达单元的HCV/HBV真核表达载体。方法：分别将与HCV核心区基因互CDNA和HBC核心区基因克隆于具有2套独立表达单元的真核表达载体pRSC的巨细胞病毒启动子和RSV启动子下游，称为PRSC-HBV/HCV，转染SP2/0细胞，通过免疫荧光和Western印迹法观测蛋白的表达，免疫Balb/c小鼠，用酶联免疫小鼠体液免疫应答。结果：PRSC-HBV/HCV转染SP2/0细胞可见HBCAG及HCV核蛋白染色阳性荧光细胞，SDS-Page电泳显示在14KD及21KD处均可见蛋白条带，与HBCAG及HCV核蛋白的理论预期值一致，Western印迹分析显示在14KD及21KD处可见特异性的蛋白条带。5只免疫鼠中全部 出现抗-HCV及抗-HBV抗体，而对照组全阴性。结论：PRSC-HBV/HCV可分别表达HBCAG与HCV核蛋白，免疫Balb/c小鼠后诱导其体液免疫应答，为进一步开展HCV/HBV联合基因免疫尊定了实验基础。     

骨髓干细胞移植治疗肝硬化的研究进展

骨髓干细胞(BMSC)是一类具有自我更新和分化潜能的细胞群,具有极强的可塑性.BMSC在体内可分化成有功能的肝样细胞和胆管细胞,可通过不同的机制,促进肝功能恢复.BMSC移植到肝脏,还能产生一系列生长因子和细胞因子,抑制炎性反应,减少肝细胞凋亡,抑制肝星状细胞活化,减少肝纤维化,为中、晚期肝硬化的治疗提供了新方法.此文就BMSC与肝脏的关系,BMSC的提取分离方法和移植途径,以及在肝硬化治疗方面的进展作一综述.     

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3在原发性肝癌中的表达及临床意义

目的 探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3,GPC3)在原发性肝癌中的表达及临床意义.方法 采用免疫组化法检测45例手术切除的原发性肝癌及癌旁组织中GPC3的表达水平,比较原发性肝癌不同临床病理特征中GPC3的表达差异,分析GPC3表达与临床和病理因素的相关性.结果 肝癌组织GPC3表达评分[(10.3±2.5)分]显著高于癌旁组织[(3.2±0.8)分],差异有统计学意义(P＜0.05);不同性别、年龄组间GPC3蛋白表达比较,差异无统计学意义(P＞0.05),而不同临床分期、肿瘤直径及有无转移患者比较,差异有统计学意义,GPC3在临床分期晚、肿瘤直径大、分化程度低及远处有转移的患者肝癌组织中表达强度增高(P＜0.05).logistic回归分析显示,PHC患者肝癌组织中GPC3表达与临床分期、肿瘤直径、分化程度及远处有转移等因素紧切相关(OR=0.623～0.960,P＜0.05).结论 GPC3蛋白在肝癌组织中呈高表达状态,对于其病情的诊断及预后评估具有重要价值.     

蒙古国人丙型肝炎患者HCV RNA检测及基因型的研究

目的通过检测丙型肝炎病毒基因分型,探讨蒙古国抗-HCV阳性患者血清中HCV基因型流行株特征。方法采用基因芯片法对蒙古国183例抗-HCV阳性患者血清标本进行基因型检测,同时检测相关病毒学及肝功能生化指标,分析基因型分布特点和临床意义。结果 183例抗-HCV阳性患者中HCV RNA阳性134例(73.2%),其中基因1b型68例(50.7%),2a型59例(44.0%),并有少量的1a、3a、1b+2a和其它3例混合型。结论抗-HCV阳性并非HCV感染直接标志,蒙古国感染HCV患者的基因型以1b和2a型为主,比例基本相当;基因型在性别上人群分布差异无统计学意义。     

黄芩素对肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤作用研究

目的:研究黄芩素对肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤作用。方法:以H22肝癌细胞接种于正常小鼠左前肢腋窝皮下复制肝癌H22荷瘤模型。实验分为模型对照、环磷酰胺(30mg·kg-1)和黄芩素高、中、低剂量(80、40、20mg·kg-1)组。灌胃给药,每天1次,连续15d。末次给药后处死小鼠,剥离完整的肿瘤组织称重,并计算肿瘤抑制率;流式细胞仪分析细胞周期分布和凋亡率;按试剂盒说明书测定肿瘤组织中半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的活性;RT-PCR测定瘤组织中B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达水平。结果:高、中剂量黄芩素可显著抑制模型小鼠体内肿瘤生长(P<0.01或P<0.05),抑制率分别为61.63%和44.65%;可显著提高G0/G1期细胞百分比(P<0.05),并减少S期细胞(P<0.01或P<0.05)。与模型对照组比较,黄芩素高、中、低剂量组细胞凋亡率显著提高(P<0.01或P<0.05)。高、中剂量黄芩素可显著增强肿瘤组织中Capcase-3活性(P<0.01或P<0.05),抑制Bcl-2mRNA表达(P<0.01或P<0.05);高剂量黄芩素可显著提高肿瘤组织中BaxmRNA表达(P<0.05)。结论:黄芩素可促进肝癌H22荷瘤小鼠肿瘤细胞的凋亡,其机制可能与增强Capcase-3活性、提高Bax表达,并抑制Bcl-2表达有关。