5种结核分枝杆菌Rpf样蛋白的活性鉴定及促生长作用

目的探讨结核分枝杆菌5种Rpf样蛋白(RpfA、RpfB、RpfC、RpfD、RpfE)的生物学活性及其促生长作用。方法根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列分别设计5种Rpf样蛋白特异性引物序列,采用PCR技术扩增目的片段,克隆、表达及纯化结核分枝杆菌的5种Rpf样蛋白,应用获得的Rpf样蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的促生长活性观察。结果成功获得了纯化的五种Rpf重组蛋白,其浓度分别为374.76μg/mL、300μg/mL、116.27μg/mL、306.9μg/mL、349.8μg/mL;促生长效果观察,其中RpfC无明显的促生长活性,RpfE的促生长活性最明显;A、B和D均有一定程度的促进这三种菌生长增殖的作用。结论Rpf样蛋白具有促进结核分枝杆菌增殖的作用,有可能成为一种新型的培养基添加剂,为结核菌的快速培养及相关研究奠定基础。     

IgG Fab—BPI融合蛋白真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建抗抗LPS Fab-BPI真核表达载体,并在CHO细胞中表达。方法 通过RT－PCR,获得广谱抗LPSmAbC3A3（IgG)的Fd和完整轻链（LC）cDNA片段。在分别构建了pcDCNA3-Fd和pcDNA3-LC表达载体的基础上,将包括BPI N端抗LPS活性中心的180bpDNA片段,通过一段长16个氨基酸的linker连接于上述Fab表达载体中Fd基因的下游,构建成Fab-BPI融合蛋白（FB）真核表达载体。将pcDNA3-LC质粒中包括hCMV启动子、LC和BGH polyA等序列在内的片段,插入到pcDNA3-Fd中hCMV启动子上游,从而构建成单质粒的Fab-BPI表达载体pcD-NA3-FB,转染真核细胞。结果 序列测定表明,重组质粒构建正确。pcDNA3－FB转染CHO细胞后,经ELISA、免疫荧光和mRNA鉴定表达成功,免疫印迹试验显示,与抗k轻链和抗BPI抗体反应的慢白区带的Mr均为60000左右。交叉反应试验证明,Fab和FB与多种革兰氏阴性菌的LPS有交叉反应性。结论 成功地在CHO细胞中表达出了抗LPS Fab-BPI(FB)融合蛋白。FB作为融合蛋白,集广泛交叉反应性和强大中和活性于一身,有可能成为更适于临床应用的新的抗LPS免疫制剂。     

聚合酶链反应检测肺炎衣原体方法的建立与初步应用

目的 探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术在肺炎衣原体检测中的应用。方法 参照Ｃａｍｐｂｅｌｌ报道的肺炎衣原体全基因序列、Ｇ＋Ｃ比例和次级结构设计一对引物，采用ＰＣＲ法检测肺炎衣原体ＤＮＡ有临床标本中的肺炎衣原体感染。结果 经对肺炎衣原体、沙眼衣原体、大肠埃希菌、溶血性链球菌、白色念珠菌和结核分枝杆菌培养物进行ＰＣＲ扩增，结果只有肺炎衣原体出现单一４３７ｂｐ的扩增区带；敏感性试验可检测出１０ｆｇ的肺炎衣     

人羧肽酶A1活性中心基因的克隆及原核表达

目的：克隆人羧肽酶A1(carboxyrpeptidase A1，CPA1)活性中心基因，构建重组表达载体并对其进行诱导表达。方法：通过RT-PCR方法扩增出正常胰腺组织中CPA1活性中心基因，克隆入载体pGEM-Teasyr，测序分析．将该目的基因亚克隆于表达载体pGEX-4T-1，测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导表达重组蛋白。结果：获得了人CPA1活性中心基因，构建了重组表达质粒，表达的蛋白以SDS-PAGE分析，在Mr约46000处出现一条新生蛋白带，经凝胶薄层扫描检测，表达量约占菌体总蛋白的22．1％。结论：成功克隆人CPA1活性中心基因并得到了其原核表达产物，为获得分子量小而具有相似活性的蛋白奠定了基础。     

吖啶橙荧光法检测泌尿生殖道分泌道中的沙眼衣原体

AIM:To explore the value and significance of detecting the chlamydia trachomatis(CT)from urogenital tract samples by the acridine orange fluorescence(AOF).METHODS:110 samples from urogenital tract were detected by AOF.RESULTS:The total positive rate is 49.0%,in which the male are 53.0%(16/30) the female are 45.0%(38/40).CONCLUSION:AOF is combination of fluorescence method and morphologic.It showes the characteristics of easiness and fastness,and can be used in screening the infection of the Chlamydia trachomatis.     

志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌多重PCR快速检测体系的建立

目的 建立快速检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR方法.方法 根据志贺菌ipaH基因、沙门菌ipaB基因及霍乱弧菌EPSM基因设计特异性PCR引物,加热煮沸法制备DNA模板,进行PCR扩增及琼脂糖电泳检测.结果 应用所建立的多重PCR方法能分别或同时快速、特异地检测出志贺菌606bp、沙门菌314bp和霍乱弧菌482bp的目的基因.结论 初步建立了灵敏、特异的一步法检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系,可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断.     

毛细管PCR实验条件的研究及其在HBV—DNA检测中的应用

聚合酶链反应（PCR）技术，在我国的应用越来越广泛，而且有普及的趋势。毛细管PCR技术是近年来在国外发展的一种快速PCR技术，其原理是：利用毛细管对热高度敏感的特点，加快热循环的速度，称为快速热循环系。由于是采用毛细管作反应容器，它们具有很薄的壁和很高的表面积体积比，因此导热性远远强于塑料管，使样品受热温度更快，加之毛细管PCR技术采用高速空气流作为加热、冷却介质，保证了温度的均一性，温度的迅速变化以及样品和空气间快速的热传导，提高了样品温度的变迁事。所以毛细管PCR技术，具有超快的循环速度、反应体积小…     

杀菌/通透性增加蛋白的细胞定位

目的 确定人体能产生杀菌/通透性增加蛋白（bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)的细胞群体,为研究BPI在细胞内的定位奠定基础。方法 分离人外周血获得嗜中性多形核粒细胞（polymorphonuclear neutrophils,PMN）和单个核细胞,PMN,HL-60及单个核细胞分别进行RNA提取,逆转录PCR反应扩增BPI基因片段和免疫荧光法检测。结果 逆转录PCR在PMN和HL-60细胞中扩增出BPI基因片段,活细胞免疫荧光染色观察到PMN和HL-60能够与抗BPI的单抗所结合而呈阳性。结论 BPI是中性粒系细胞的特异性产物。     

肝硬化合并新型隐球菌性脑膜炎1例

虽然肝硬化患最常见合并细菌性感染，但细菌性脑膜炎非常少见。而肝硬并隐球菌性脑膜炎更为罕见。现就我科收治1例肝硬化合并新型隐球菌性脑膜炎报告如下。