一种准确快速微量尿素氮测定法

报告尿素经脲酶作用后Berthelot反应测定法。该法较纳氏试剂显色法具有灵敏度高,稳定性强,检品用量少等优点。通过测定了831例正常人BUN的结果,探讨年龄与BUN正常值的关系,并对肾功能障碍时其血中NPN及BUN平行测定作了观察。     

反义c-myc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌增殖与细胞凋亡无关

目的 :研究反义c myc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌增殖与细胞凋亡的关系 .方法 :大鼠气道平滑肌细胞原代培养 ,4～ 12代用于实验 .利用Lipofectin将正义、反义及错配c myc寡核苷酸导入大鼠气道平滑肌细胞 ,姬姆萨染色查找凋亡小体 ,流式细胞技术观察有无凋亡峰出现 ,琼脂糖电泳观察凋亡细胞特有的梯状图谱 ,免疫组织化学染色检测凋亡相关基因bax和bcl 2 .结果 :反义c myc寡核苷酸处理大鼠气道平滑肌细胞 2 4h后 ,细胞生长明显受到抑制 (0 .12± 0 .0 3vs 0 .19± 0 .0 5 ,P <0 .0 1) ,但无凋亡小体发现 ,流式细胞技术没有检测到凋亡峰 ,细胞总DNA琼脂糖电泳没有观察到典型的梯状凋亡图谱 ,免疫组织化学染色显示凋亡相关基因产物Bax及Bcl 2在各组表达无明显差异 .结论 :反义c myc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌增殖与细胞凋亡无关     

男性无精子症和严重少精子症患者SPGY1基因微缺失的检测

目的：研究Y染色体上无精子因子(AZoospermia Factor,AZF)的缺失与无精症和严重少精子症的关系．方法：应用PCR方法检测了40例正常男子、42例无精子症和31例严重少精子症男子基因组DNA中AZFc区的SPGYl(SPer-matogenesis Gene locus on the Y)基因．结果：无精子症患中6例SPGYl基因缺失(6／42)；严重少精子症患中5例SP—GYl基因缺失(5／31)；73例男性不育患AZFc区SPGYl基因缺失率为15％(11／73)．40例已生育的正常男性对照均未检测到SPGYl基因的缺失．结论：Y染色体SPGYl基因缺失可能是造成男性不育的原因之一，有必要对男性不育患进行Y染色体基因缺失的检测。     

荧光定量RT-PCR检测沙门氏菌方法的建立

目的建立沙门氏菌实时荧光定量PCR的快速检测方法 ,探讨该方法的可行性和应用价值。方法根据沙门氏菌fimY基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于沙门氏菌检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测沙门氏菌的方法。结果成功构建了沙门氏菌重组质粒标准品和沙门氏菌实时荧光定量PCR方法 ;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,为食源性沙门氏菌污染的快速检测提供依据,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等。     

PSMA-IRES-FCY1-TK真核表达载体的构建及在前列腺癌细胞中的表达

目的: 构建前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子调控表达的FCY1/TK双自杀基因表达载体,并观察单、双自杀基因对前列腺癌细胞LNCaP的杀伤作用.方法: 通过PCR方法扩增出基因组DNA中PSMA启动子,利用基因重组的方法,替换真核表达载体pIRES中的CMV启动子.测序正确后,再将自杀基因FCY1和HSV-TK分别克隆于载体pIRES的两个多克隆位点,构建真核表达载体pPSMA-IRES-FCY1-TK.将该载体转染LNCaP细胞,用RT-PCR的方法检测其转录,用MTT法检测前体药物5-氟胞嘧啶、丙氧鸟苷单一或联合使用对转染后的LNCaP细胞的杀伤作用.结果: PCR扩增出长1400 bp的PSMA启动子片段,经克隆至pIRES后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank(Accession Number AF007544)报道的一致.pPSMA-IRES-FCY1-TK经脂质体转染LNCaP细胞后,RT-PCR检测到FCY1和TK基因在该细胞中均有转录.MTT法检测表明5-FC与GCV联合使用,其细胞生长抑制率明显高于单独使用5-FC,GCV(P<0.05). 结论: pPSMA-IRES-FCY1-TK的双自杀基因体系对前列腺癌细胞LNCaP细胞的杀伤作用,明显优于单自杀基因体系.     

多巴胺D2受体启动子区域基因多态性与抽动-秽语综合征的关联分析

目的:探讨抽动-秽语综合征(TS)与多巴胺D2受体启动子区域(DRD2P)多态性的关系.方法:应用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性技术对24例患儿和30例正常对照进行DRD2P基因-141CDel/Ins多态性和TS的关联性分析.结果:共检出2种基因型:纯合子-141CIns/Ins(160bp,144bp)与杂合子-141CDel/Ins(304bp,160bp,144bp),未检出纯合子-141CDel/Del(304bp,304bp).病例组-141CDel/Ins多态性的基因型频率与对照组的差异无显著性(χ2=0.093,ν=2,P＞0.05);等位基因频率比较也无显著性差异(χ2=0.060,ν=1,P＞0.05).结论:抽动-秽语综合征与DRD2P基因-141CDel/Ins多态性尚缺乏关联.     

PCR-反相杂交法检测沙门氏菌invA、invE基因

目的：探讨从血液中早期检出伤寒沙门氏菌病原体的方法。方法：选择沙门氏菌属中的ｉｎｖＡ ｉｎｖＥ,采用ＰＣＲ扩增－反相杂交法及电泳法同时对血培养物中的伤寒沙门氏菌进行对比检测。结果：电泳法６ｈ检出８份,检出率８０％。８ｈ、１０ｈ可将１０份全部检出,检出率为１００％。反相杂交法４ｈ有３份阳性,阳性率为３０％,６ｈ有９份出现阳性反应,阳性率为９０％,８ｈ、１０ｈ可将１０份全部检出,阳性率为１００％。临床标本中电泳法１２／１６阳性,阳性率７５％,ＰＣＲ－反相杂交法阳性１４／１６,阳性率８７．５％。结论：反相杂交法具有敏感性高、特异性好等优点,对伤寒的早期快速诊断及治疗有重要意义。     

5种结核分枝杆菌Rpf样蛋白的活性鉴定及促生长作用

目的探讨结核分枝杆菌5种Rpf样蛋白(RpfA、RpfB、RpfC、RpfD、RpfE)的生物学活性及其促生长作用。方法根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列分别设计5种Rpf样蛋白特异性引物序列,采用PCR技术扩增目的片段,克隆、表达及纯化结核分枝杆菌的5种Rpf样蛋白,应用获得的Rpf样蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的促生长活性观察。结果成功获得了纯化的五种Rpf重组蛋白,其浓度分别为374.76μg/mL、300μg/mL、116.27μg/mL、306.9μg/mL、349.8μg/mL;促生长效果观察,其中RpfC无明显的促生长活性,RpfE的促生长活性最明显;A、B和D均有一定程度的促进这三种菌生长增殖的作用。结论Rpf样蛋白具有促进结核分枝杆菌增殖的作用,有可能成为一种新型的培养基添加剂,为结核菌的快速培养及相关研究奠定基础。     

IgG Fab—BPI融合蛋白真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建抗抗LPS Fab-BPI真核表达载体,并在CHO细胞中表达。方法 通过RT－PCR,获得广谱抗LPSmAbC3A3（IgG)的Fd和完整轻链（LC）cDNA片段。在分别构建了pcDCNA3-Fd和pcDNA3-LC表达载体的基础上,将包括BPI N端抗LPS活性中心的180bpDNA片段,通过一段长16个氨基酸的linker连接于上述Fab表达载体中Fd基因的下游,构建成Fab-BPI融合蛋白（FB）真核表达载体。将pcDNA3-LC质粒中包括hCMV启动子、LC和BGH polyA等序列在内的片段,插入到pcDNA3-Fd中hCMV启动子上游,从而构建成单质粒的Fab-BPI表达载体pcD-NA3-FB,转染真核细胞。结果 序列测定表明,重组质粒构建正确。pcDNA3－FB转染CHO细胞后,经ELISA、免疫荧光和mRNA鉴定表达成功,免疫印迹试验显示,与抗k轻链和抗BPI抗体反应的慢白区带的Mr均为60000左右。交叉反应试验证明,Fab和FB与多种革兰氏阴性菌的LPS有交叉反应性。结论 成功地在CHO细胞中表达出了抗LPS Fab-BPI(FB)融合蛋白。FB作为融合蛋白,集广泛交叉反应性和强大中和活性于一身,有可能成为更适于临床应用的新的抗LPS免疫制剂。     

RNA干扰技术及其在前列腺癌基因治疗研究中的应用

RNA干扰(RNA i)是指生物体内由双链RNA(dsRNA)介导同源序列mRNA的特异性降解,从而导致基因沉默的现象。近年来,随着对RNA i研究的不断深入,其作用机制正逐步阐明;同时作为阻断基因表达的新手段,RNA i技术也日趋完善和成熟。它具有高效性和特异性,为RNA i在肿瘤的基因治疗方面的应用提供了有力的工具。本文综述RNA i技术的有关研究进展及其在前列腺癌基因治疗研究中的应用。