多重聚合酶链反应快速检测脑膜炎中的病原体

目的 建立脑膜炎多重PCR检测系统,以在一次扩增中快速、特异地同时检出新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌,用于脑膜炎病原体感染的快速诊断。方法 根据新型隐球菌URA保守序列、脑膜炎双球菌基因组中特定的H.8外膜蛋白基因序列、结核分枝杆菌基因组中的IS986插入基因序列片段,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用多重PCR技术,同时检出脑脊液中的新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌。结果 应用多重PCR反应体系,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果：我重PCR扩增的预期结果为：单一菌感染出现一条特异性扩增区带;混合感染应出现2条或3条特异性扩增区带,经实验达到预期的扩增结果;对15份已明确诊断的脑脊液标本,分法均能扩增出预期的目的片段。符合率达100%,对20例临床脑脊液标本的PCR扩增结果分别为：新型隐球菌15%（3/20）、结核肝菌20%（5/20）、脑膜炎双球菌10%（2/20）。结论 多重PCR有效地为临床病原体的混合感染,以及原因不明的脑膜炎患的快速诊断,提供了快速、准确的诊断手段。有效地减少了脑膜炎的误诊和漏诊,更提高了检验效率。     

前列腺癌自杀基因治疗中组织特异性启动子的研究进展

随着自杀基因治疗成为治疗恶性肿瘤的重要方法,其中组织特异性启动子是目前研究的热门之一.前列腺癌自杀基因治疗常用的组织特异性启动子有PSA及Probasin等,其中PSA,Probasin为雄激素依赖性,对于未经雄激素去势治疗的前列腺癌治疗效果较好;而PSMA为雄激素非依赖性,对于是否经过雄激素去势治疗的前列腺癌均有良好疗效,适用范围广.     

链霉亲和素-自噬相关基因融合蛋白的原核表达及纯化

目的 构建链霉亲和素（streptavidin,SA）和自噬相关基因（Beclin 1）重组质粒,并对融合蛋白SA-Beclin 1进行表达和纯化.方法 利用基因重组技术将核心SA与Beclin 1序列连接,克隆人pQE80形成pQE80-SA-Beclin 1重组载体,IPTG诱导融合蛋白原核表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blot鉴定.结果 PCR成功扩增核心SA活性中心,酶切鉴定和测序均证实重组载体pQE80-SA-Beclin 1构建成功;IPTG诱导后SA-Beclin 1融合蛋白（含His标签）在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE分析表达的融合蛋白以包涵体为主,经镍亲和凝胶层析柱纯化得到融合蛋白,Western blot鉴定其相对分子量约为72000kD,与预期相符.结论 本文成功构建了重组质粒并表达纯化了SA-Beclin 1融合蛋白,为进一步研究SA-Beclin 1的功能及临床应用奠定了基础.     

快速检测耐异烟肼结核分支杆菌方法的研究

目的 应用多重聚合酶链反应-单链构象多态性分析（multiple—Polymerase Chain Reaction—Single Strand Conformation Polymorphism,multi—PCR—SSCP）方法,快速、特异地同时检出耐异烟肼（isoniazid,INH）结核分支杆菌aphC启动子、inhA、katG基因的突变情况,并与直接测序（derictsequencing,DS）结果相比较,参照药敏试验,探讨该方法的可行性。 方法 根据结核分支杆菌的aphC启动子序列、inhA序列、katG序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用multi—PCR-SSCP技术,同时检测对结核分支杆菌耐INH起作用的这三个基因的突变情况;同时进行耐药株的测序分析。 结果 对H37Rv标准株、临床分离INH敏感株（23株）及INH耐药株（35株）进行multi—PCR—SSCP分析,突变检出率82．9％（29／35）;耐药株测序分析突变检出率为85．7（30／35）。两种方法的符合率为97．1％E（29＋5／）／35]。 结论 耐药基因检测指导治疗是一种新探索,multi—PCR—SSCP方法敏感、特异,能同时快速有效地检测结核分支杆菌aphC启动子、inhA、katG三个INH耐药基因的突变,提高检验效率,有望成为临床指导用药的好方法。     

RNA干扰技术及其在前列腺癌基因治疗研究中的应用

RNA干扰(RNA i)是指生物体内由双链RNA(dsRNA)介导同源序列mRNA的特异性降解,从而导致基因沉默的现象。近年来,随着对RNA i研究的不断深入,其作用机制正逐步阐明;同时作为阻断基因表达的新手段,RNA i技术也日趋完善和成熟。它具有高效性和特异性,为RNA i在肿瘤的基因治疗方面的应用提供了有力的工具。本文综述RNA i技术的有关研究进展及其在前列腺癌基因治疗研究中的应用。     

基于PCR-RDB法对陕西地区HCV基因型别的研究

目的 探讨聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)-反向点杂交法(reverse dot blot,RDB)在陕西地区丙型肝炎病毒基因分型中的应用.方法 选取陕西地区610例丙型肝炎患者,利用PCR-RDB法进行丙肝病毒基因型检测,并使用SPSS对检测结果进行统计学分析. 结果 610例丙肝患者检出1b型273例(44.75％),2a型286例(46.89％),3a型30例(4.92％),3b型11例(1.80％),6a型10例(1.64％);各基因型间的患者性别比例的差异具有统计学意义(P＜0.05);与其他基因型别相比,HCV 3a型患者年龄水平最低,差异显著(P＜0.05). 结论 陕西地区丙肝病毒以2a、1b型为主,患者性别及年龄与所感染HCV型别有关联性;PCR-RDB技术在丙型肝炎病毒基因分型中的应用有利于HCV分型在临床上的推广.     

志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌多重PCR快速检测体系的建立

目的 建立快速检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR方法.方法 根据志贺菌ipaH基因、沙门菌ipaB基因及霍乱弧菌EPSM基因设计特异性PCR引物,加热煮沸法制备DNA模板,进行PCR扩增及琼脂糖电泳检测.结果 应用所建立的多重PCR方法能分别或同时快速、特异地检测出志贺菌606bp、沙门菌314bp和霍乱弧菌482bp的目的基因.结论 初步建立了灵敏、特异的一步法检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系,可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断.     

人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因在CHO细胞中的表达

目的获得人杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)N端活性片段蛋白,为BPI结构和功能的研究提供有力的工具。方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPIN端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染CHO细胞并筛选阳性克隆,免疫荧光法鉴定重组BPI的表达和免疫学活性。结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,与文献报道的序列相比,有6个核苷酸差异。转染筛选的阳性CHO细胞克隆表达产物能够被抗BPI的单克隆抗体所识别。结论BPI活性片段表达载体的构建及真核表达成功,为BPI功能的研究奠定了基础。     

外源性野生型p53基因对人肺腺癌细胞系GLC-82的生物学效应

目的：研究外源性野生型ｐ５３基因对人肺腺癌细胞系ＧＬＣ－８２的生物学作用。方法：将含有野生型ｐ５３基因的ｐＤＯＲ－ｎｅｏ逆转录病毒载体，通过ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染ＧＬＣ－８２细胞，用流式细胞仪、电镜及３Ｈ－ＴｄＲ掺入法，观察野生型ｐ５３基因对ＧＬＣ－８２细胞的生物学效应。结果：电镜观察可见，转染野生型ｐ５３基因，可使ＧＬＣ－８２细胞出现一些病理现象，如胞浆中有明显的空泡及线粒体肿胀；流式细胞仪分析显示，野生型ｐ５３基因可阻止ＧＬＣ－８２细胞周期停止于Ｇ１～Ｓ区；３Ｈ－ＴｄＲ掺入试验提示，野生型ｐ５３基因能够抑制ＧＬＣ－８２细胞ＤＮＡ的合成。结论：这些结果阐明了野生型ｐ５３基因是抑制ＧＬＣ－８２细胞生长的部分机理。