Toll样受体2胞外域及其氨基端和羧基端片段的克隆与序列分析

目的：为研究TLR2胞外域在肽聚糖诱导的信号转导中的功能，构建TLR2胞外域及其氨基端和羧基端片段真核表达载体。方法：提取HL－60细胞总RNA，以RT－PCR方法获取了TLR2胞外域cDNA片段，将其与pGEM-T Easy载体连接，转化E.coli JM109,建立了TLR2胞外域的cDNA克隆；籍此，又相继克隆了胞外域的氨基端和羧基端片段，然后将这三个片段克隆到真核表达载体pcDNA3中。结果：序列分析表明，与GenBank中的人TLR2全长cDNA序列比较，仅4个碱基不同，同源性为0．998。结论：成功获得了HL－60细胞TLR2胞外域及其氨基端和羧基端片段的克隆。     

构建MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1表达的腺病毒载体

目的：构建串联的MYC反应元件修饰人端粒酶逆转录酶（hTERT)核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶基因Fcy1表达的复制缺陷型腺病毒载体。方法：将串联的MYC反应元件修饰的hTERT核心启动子及下游酵母胞嘧啶脱氨酶基因Fcy1克隆到穿梭质粒pDC316上，上辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞获得重组复制缺陷型腺病毒并在HEK293细胞中扩增重组病毒。PCR法及斑形成实验鉴定重组腺病毒和病毒滴度。结果：成功获得由6倍和18倍MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1基因表达的复制缺陷型腺病毒载体。结论：MYC反应元件修饰hTERT核心启动子引导Fcy1基因表达的腺病毒载体为进一步研究骨肉瘤转录靶向基因治疗奠定了基础。     

PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌耐药性

目的：探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系以及聚合酶链反应-单链构象多态性分析(poly merase chain reaction-single strand cinfomlation polymorphism，PCR-SSCP)方法的临床应用价值。方法：用PCR-SSCP方法检测58株结核分枝杆菌临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变并与常规药敏试验检测结果进行对比。结果：经常规药敏试验检测，58株结核分枝杆菌临床分离株中共有41株耐药，其中，耐异烟肼(INH)为35株，高耐药株27株；耐利福平(RFP)为31株，高耐药株24株；耐链霉素(SM)有31株，高耐药株26株。同时耐3种药物的有21株(51．2％)，耐2种药物的14株(34．1％)，单耐药株6株(14．6％)．PCR-SSCP方法对58株临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变的检测率为40％(23／58)，45％(26／58)，38％(22／58)，其中检出3个基因同时突变的有13株(32％)，2种基因突变的12株(29％)，1种基因突变的有10株(23．8％)．常规药敏试验与PCR-SSCP法检出结核分枝杆菌同时耐3种药物的符合率为61．9％(13／21)，检出耐2种药物的符合率为85．70k，(12／14)，检出耐1种药物的符合率为50％(3／6)．高耐药株中突变率为80．5％(62／77)，低耐药株中突变率为60％(12／20)．结论：PCR-SS-CP方法对耐2种以上药物的结核杆菌检出率较高，且耐药基因突变率随着耐药浓度增高而增高。将PCR-SSCP法与药敏试验联合应用可互相弥补，已成为临床指导用药的好方法。     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的 克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达.方法 采用热启动聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白.结果 经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0.6,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22.8%.结论 构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础.     

聚合酶链反应快速检测结核杆菌的临床应用

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)又称体外 DNA 扩增技术或体外核酸克隆技术,自1985年初 Saiki 建立以来,在短短的几年内获得了很大发展。Hance 最先把 PCR 技术应用到结核杆菌的诊断后,国内外相继研究应用。参考国外文献,我们设计合成了一对引物。特异性地扩增结核菌 B 蛋白基     

聚合酶链反应检测沙眼衣原体

聚合酶链反应检测沙眼衣原体苏明权，祝道成，穆士杰，丁振若（第四军医大学西京医院检验科西安７１００３３）关键词沙眼衣原体；聚合酶链反应；实验诊断中图号Ｒ５１８沙眼衣原体是人类重要的致病菌，能引起多种感染性疾病。长期以来，对沙眼衣原体感染的实验室诊断一直...     

淋病奈瑟氏菌中国流行株gyrA和parC基因与喹诺酮类耐药性的相关性

目的　调查中国地区淋病奈瑟氏菌 (NG)对喹诺酮类的耐药性状况 ,探讨高水平耐药的基因突变株对喹诺酮类耐药机制的作用 .方法　对 9a来临床分离保存淋球菌流行株进行了体外环丙沙星 (CIP)药敏实验 .筛选出 76株高水平CIP耐药株 ,通过 PCR扩增了其中的 1 8株 NG的 gyr A和par C喹诺酮耐药决定区基因 ,并对扩增子直接测序 .通过N he I酶切、脉冲电场凝胶电泳 (PFEG)分析了这些菌株的遗传关系 .结果　环丙沙星的耐药检出率有逐年增高的趋势 ,MIC≥ 1 .0 mg· L- 1的菌株由 1 993年的 5 .1 %上升到 2 0 0 1年的 2 1 .4% .对照组中的 1 8株敏感菌只有两株发生了 gyr A的单一突变 ,未发现 par C变异 ;而耐药组中 89% (1 6 )菌株的gyr A发生了 Ser- 91向 Phe的单一突变株或 (和 ) par C的双突变 .88.9% (1 5 )的菌株的 gyr A发生了 Ser- 91向 Phe和 Asp-95向 Gly的突变 .在发生 par C突变中 72 %属于 Asp- 86向Asn突变 .PFEG分析发现 1 0株具有完全一致的 gyr A和par C突变模式 .同时也发现来自不同地区的菌株的 PFEG指纹图是不同的 .结论　研究表明 ,在中国 NG流行株对喹诺酮类耐药率呈增长趋势 ;NG流行株对喹诺酮产生耐药性与gyr A和 par C基因双重突变有着密切的关系     

TTV核酸模板快速制备方法

目的 寻求建立适合大批量临床标本检测TT病毒（TTV）核酸快速制备方法,直接用于PCR扩增。方法 应用蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法与直接快速裂解法,分别制备TTV核酸做PCR模板,用于TTV的聚合酶链反应的快速检测。结果 在30例非甲－非庚型肝炎血清和50例慢性乙型肝炎患血清,应用经典的蛋白酶K裂解酚氯仿抽取法和直接快速裂解法,分别制备TTV核酸模板,在相同条件下进行PCR扩增,结果两种制备方法的符合率为89％。结论 TTV是一种新发现的肝炎病毒,目前主要以实验室检测病毒核酸的存在为诊断依据,建立了具有快速、简便、适合大批量临床标本中TTV核酸制备方法,对TTV肝炎的快速诊断,具有重要的意义。     

宫颈癌组织中端粒酶活性测定

目的 探讨端粒酶活性在子宫颈癌组织发生发展中的作用及临床应用价值。方法 采用PCR－TRAP微孔杂交法检测45例子宫颈癌组织标本和8例正常的子宫颈组织的端粒酶活性。结果 45例宫颈癌组织中端粒酶阳性表达率为86．6％,其中宫颈癌Ⅰ期27例,阳性率77．7％,宫颈癌Ⅲ期6例,阳性率100％。8例正常宫颈组织中未检测出端粒酶阳性。结论 端粒酶活性表达在子宫颈癌的发生发展中起重要的作用,端粒酶活性检测对指导宫颈癌的诊断和治疗具有重要意义。