Cdc25a在跨种属肝癌组织中的表达及其意义*

 目的：研究细胞周期通路中的细胞分裂周期蛋白25a (Cdc25a)在人、大鼠和树鼩不同种属的肝癌、癌旁及正常肝组织中的表达和意义,进一步验证跨种属筛选肝癌关键基因研究策略的可行性。方法：采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测人、大鼠和树鼩的肝癌及其相应癌旁组织以及正常肝组织中Cdc25a mRNA和蛋白表达水平。结果：Cdc25a mRNA表达水平在人、大鼠和树鼩的肝癌组织中均高于正常肝组织（均P<0.05）;在人和大鼠肝癌组织中的表达高于其对应的癌旁组织（P<0.05）;其余各组织间mRNA表达水平的差别无统计学意义（均P>0.05）。Cdc25a mRNA在人肝癌组织中的表达水平与病人的临床分期、门脉癌栓及肝外转移明显相关,而与术后复发、肿瘤直径、肿瘤个数、血清甲胎蛋白水平和肿瘤分化无明显关系。Western blotting检测结果显示Cdc25a在人、大鼠和树鼩肝癌组织中的蛋白表达水平均较癌旁和正常肝组织显著上调。结论：Cdc25a有可能是影响肝癌发生和发展的重要分子之一,跨种属筛选肿瘤关键基因策略可能有助于发现肝癌关键基因。     

黄曲霉毒素B1诱发大鼠肝癌过程中β连环蛋白的变化

许多研究表明,黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）与HCC密切相关,而β连环蛋白是近年肿瘤研究的一个热点,其基因突变和表达异常与HCC等肿瘤密切相关。研究人HCC往往只能对癌及癌旁组织（或加上正常组织）进行比较,无法知道基因在哪个阶段开始出现异常,而且患者往往在发病前接触过很多致癌因素,很难明确是哪些引起β连环蛋白表达量增高。本研究仅用AFB1处理大鼠诱发HCC,于不同时段进行肝活组织检查,[第一段]     

用树鼩cDNA芯片研究树鼩肝癌中参与信号传导的部分基因变化情况

目的利用树鼩cDNA芯片研究黄曲霉毒素B1（AFBl）和（或）乙型肝炎病毒（HBV）引起的树鼩肝细胞癌（HCC）发生过程中参与信号传导的部分基因表达变化情况，从而进一步探讨HCC发生的分子机制。方法实验树鼩分3组：A组（AFB1组）、B组（AFB1＋HBV组）、C组（正常对照组）。所有动物在实验过程中定期接受剖腹手术取肝组织检查，至肝癌形成时处死动物取肝癌和癌旁组织。用树鼩cDNA芯片检测实验第30、60、90周肝活检组织、肝癌组织及其癌旁组织中各基因的表达情况，并用实时逆转录聚合酶链反应（Real time RT-PCR）法验证cDNA芯片结果。结果在A组和B组从癌前到癌变过程中胰岛素样生长因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）、C-rel、核因子-κB2（NF—κB2）均显示有差异表达，同时bcl-2、细胞周期素A（cyclin A）、睫状神经营养因子（CNTF）仅在B组显示有差异表达。而C组这几个基因无差异表达。实验组与对照组比较，在诱癌的早、中期（30、60周）均出现CNTF及cyclin A的差异表达。realtime RT PCR结果与cDNA芯片检测结果基本一致。A组IGF-Ⅱ、C—rel基因及B组IGF-Ⅱ基因，在肝癌组织表达水平明显低于癌旁及实验30、60周组织，而癌旁与实验30、60周相比较则无明显差异；B组CNTF基因在癌旁、肝癌及60周之间比较无明显改变，但均明显高于30周；A组CNTF基因表达水平在癌旁、肝癌组织高于癌前组织，但差异无统计学意义；C组这3个基因不同时期比较亦无明显差异。结论树目自部分信号传导通路相关cDNA芯片应用于检测树目目HCC发生过程中信号传导通路中各基因表达的变化，对进一步了解树鼠甸HCC发生的机制有重要实用价值。IGF-Ⅱ、NF-κB2、C-rel、Bcl-2、cyclin A及CNTF这几个基因与树HCC的发生发展密切相关。     

跨种属研究Smad3在肝癌组织中的表达及意义

 目的：研究Smad3在人、大鼠、树鼩等不同种属的肝癌、癌旁及正常肝组织中的表达和意义,进一步验证跨种属筛选肝癌关键蛋白研究策略的可行性。方法：采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测人、大鼠和树鼩的肝癌及其相应癌旁组织以及正常肝组织中Smad3 mRNA和蛋白表达水平。结果：Smad3 mRNA在人、大鼠和树鼩的肝癌中表达水平均低于其相应的癌旁组织（均P<0.05）;在大鼠肝癌组织中的表达低于正常肝组织（P<0.05）;在树鼩癌旁组织中的表达高于正常肝组织（P<0.05）;其余各组织间mRNA表达水平的差别无统计学意义（均P>0.05）。Smad3蛋白在人和大鼠的肝癌组织中的表达水平均低于其相应的癌旁组织及正常肝组织（均P<0.05）;在树鼩肝癌组织中的表达水平也低于相应的癌旁组织和正常肝组织,但差别无统计学意义（均P>0.05）;3个种属的癌旁组织与正常肝组织比较,差别无统计学意义（均P>0.05）。结论：Smad3在人、大鼠和树鼩3个种属的肝癌组织中的mRNA和蛋白表达水平均下调,提示该蛋白表达水平的改变可能在肝癌发生发展中起重要作用,有可能成为防治肝癌的靶分子。     

树实验肝癌发生过程中IGF-Ⅱ、HBxAg、p21和p53蛋白的表达

目的：探讨ＨＢＶ与ＡＦＢ１协同致肝癌作用机制。方法：用免疫组化观察５３只树鼠句肝及肝癌组织ＩＧＦ－Ⅱ、ＨＢｘＡｇ、ｐ２１及ｐ５３蛋白表达。结果：接受ＨＢＶ和ＡＦＢ１的树鼠句肝癌诱发率和ＩＧＦ－Ⅱ、ＨＢｘＡｇ、ｐ２１检出率分别为５２．９％、８２．４％、５２．９％及２９．４％；只感染ＨＢＶ的分别为１１．１％、２２．２％、１１．１％和１１．１％；仅摄入ＡＦＢ１的分别为１５．８％、２６．３％及１５．８％（ｐ２１）；空白对照无肝癌及上述基因蛋白表达。带瘤肝ＩＧＦ－Ⅱ、ＨＢｘＡｇ及ｐ２１检出率均显著高于无瘤者，而表达这３种基因蛋白的动物肝癌发生率也均明显高于阴性者。突变的ｐ５３蛋白表达仅见于７例（５８．３％）中低分化的肝癌。结论：ＨＢＶ与ＡＦＢ１共同激发这些基因的异常表达可能是其协同致肝癌机制之一。ＩＧＦ－Ⅱ过表达可能作为癌变早期信号应引起重视     

大鼠肝癌形成过程MCM7基因动态变化

目的：4g讨MCM7基因在黄曲霉毒素B1（AFB1）实验诱发大鼠肝癌过程中的动态变化及意义。方法：将70只雄性4周龄Wistar大鼠随机分为AFB1组（50只）和对照组（20只）,AFB1组腹腔注射AFB1,对照纽则给予溶媒二甲基亚砜。在诱发肝癌过程中,分别于第13、33和53周对大鼠进行肝活检;实验至第73周处死全部大鼠取肝组织;采用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法和免疫组化方法检测肝组织中MCM7rnRNA和蛋白的表达情况。结果：AFB1组肝细胞癌发生率为44．1％（15／a4）,对照组为0（0／16）,AFB1组显著高于对照组,χ^2=8．093,P〈0．001。随着大鼠肝癌的形成,MCM7mRNA和蛋白的表达水平逐步升高,AFB1组第53和73周显著高于第13和33周,F值分别为55．632和207．253,P值均〈0．001;对照组各时间点的表达较低且变化不大。免疫组化结果显示,AFB1组第53周McM7蛋白阳性表达率为26．7％且以弱阳性为主,第73周MCM7蛋白阳性表达率为100％且多为强阳性,阳性表达率和表达强度均比其他时间点的高,两者比较差异均有统计学意义,P值均〈0．001。结论：MCM7表达水平随着肝癌的形成逐渐上升,且在肝癌组织中表达最高,MCM7有可能是参与肝癌形成的关键基因,但其详细机制有待进一步探讨。     

慢性乙型肝炎病毒感染树鼩Kupffer细胞TLR2和TLR4的表达及其意义

目的探索慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染树鼩Kupffer细胞Toll样受体(TLR)家族中的TLR2和TLR4在mRNA水平的表达情况及其对Kupffer细胞功能的影响。方法树鼩分为确定慢性感染HBV的树鼩、疑似慢性感染HBV的树鼩和未接种HBV的正常对照树鼩。全部动物定期抽血和进行肝活检手术,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析血清和肝组织的HBV DNA水平;对手术切取的树鼩肝组织进行Kupffer细胞的分离、纯化和原代培养,采用qRT-PCR检测TLR2、TLR4以及TNF-α的mRNA表达水平;采用迁移实验及溶酶体荧光探针等方法分析TLR2和TLR4对Kupffer细胞迁移能力及溶酶体数量的影响。结果确定慢性感染HBV的树鼩TLR2 mRNA和TLR4 mRNA表达水平均低于疑似慢性感染HBV的树鼩和未接种HBV的正常对照树鼩(P0.05),表达水平均与动物肝组织的HBV DNA拷贝数呈负相关(P0.05),与Kupffer细胞的细胞迁移数、溶酶体密度及TNF-αmRNA表达水平呈正相关(P0.05)。结论 Kupffer细胞中的TLR2和TLR4可能通过影响Kupffer细胞功能而参与树鼩HBV感染后肝脏病变的慢性化发展过程。     

EGFR、EGFRvⅢ在肝细胞癌中的表达及意义

目的：探讨表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（epidermal growth factor receptor varianttypeⅢ。EGFRvⅢ）与肝细胞癌（HCC）的关系。方法：应用免疫组化SP方法检测55例HCC及癌旁肝组织中EGFR和EGFRvⅢ的表达情况。结果：EGFR在HCC中的阳性表达率（58．18％,32／55）高于癌旁肝组织的阳性率（36．36％,20／55）,两组差异有统计学意义（P〈0．05）。EGFRvⅢ在HCC中的阳性率（61．82％,34／55）高于癌旁肝组织的阳性率（38．18％,51／55）,两组差异有统计学意义（P〈0．05）。EGFR蛋白在HCC组织中的检出率与临床分期、门静脉癌栓、肝外转移、术后复发相关（P〈0．05）,EGFRvⅢ蛋白在HCC组织中的检出率与临床分期、门静脉癌栓、肝外转移、术后复发、肿瘤大小相关（P〈0．05）。结论：EGFR、EGFRvⅢ在HCC的发生、发展和转移中起重要作用,可作为预测HCC复发、转移的参考指标。     

银杏叶提取物对黄曲霉毒素B_1诱发大鼠肝癌过程中生物标志物的影响

目的:探讨银杏叶提取物(extract 761 from Ginkgo biloba,EGb761)对黄曲霉毒素B_1(aflatoxin B_1,AFB_1)在大鼠体内代谢的影响.方法:经AFB_1和EGb761不同处理,获得AFB_1组、AFB_1+EGb761组和空白对照组3组大鼠,分别于实验第14、28及42周给予抽血及肝活检,并于第64周全部处死.观察大鼠肝癌发生率,用分光光度法检测肝组织Ⅰ相酶CYP450和Ⅱ相酶GST活性,用高效液相色谱法检测血清AFB_1-赖氨酸加合物水平,以及应用免疫组织化学法检测8-羟基脱氧鸟嘌呤核苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)蛋白表达情况.结果:肝癌诱发率在AFB_1+EGb761组明显低于AFB_1组(P<0.001),而对照组无肿瘤发生;EGb761对Ⅰ相代谢酶CYP450及Ⅱ相代谢酶GST活性无明显影响.血清AFB_1-赖氨酸加合物的最高水平(4 356.01 pg/mg albumin)发生于实验第14周的AFB_1组.在实验第14、42周时EGB761显著抑制了血清AFB_1-赖氨酸加合物的形成,抑制率分别为13.07% (P＝0.033)、73.63% (P＝0.002).在各检测点的8-OHdG蛋白表达强度显示,AFB_1+Egb 761组均显著低于AFB_1组(P<0.05).结论:EGb761阻断AFB_1致肝癌发生的主要机制可能不完全是通过影响肝脏Ⅰ、Ⅱ相代谢酶活性的途径实现的.EGb761能够抑制AFB_1-赖氨酸加合物的形成,降低8-OHdG蛋白的表达,减轻DNA的氧化损伤,这可能是其最终抑制或延缓AFB_1诱发肝癌发生、发展的机制之一.