江苏地区汉族儿童多药耐药基因3个单核苷酸多态性位点的单倍型研究

目的分析江苏汉族人群多药耐药基因-1（MDR1）的单核甘酸多态（12外显子1236C→T突变、21外显子2677G→T/A突变、26外显子3435C→T突变）及其构成的单倍型分布。方法通过多重单碱基延伸反应（SNaPshotSNP分型技术）对江苏地区170名健康儿童的MDR1C1236T、G2677T/A、C3435T的SNP位点进行基因分型,统计各基因型频率。UNPHASED软件对MDR1的SNPs（C1236T-G2677T/A-C3435T）进行单倍型分析。结果在170例儿童中,等位基因1236T、2677T、2677A、3435T频率分别为63.5%、37.4%、17.0%和35.0%。基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡（HWE）,差异无统计学意义（P〉0.05）。MDR1的1236、2677、3435三个位点间（C1236T-G2677T/A-C3435T）存在连锁不平衡性,以TTT（31.8%）、TGC（25.3%）、CGC（17.7%）和CAC（16.2%）四种单倍型为主。结论江苏地区汉族人群MDR1的单核甘酸多态及单倍型分布具有自己的特点。在临床应用相关药物时,进行基因型及单倍型检测,将有助于指导临床个体化用药。     

两种诱导治疗方案治疗儿童急性髓系白血病效果观察

目的评价两种诱导缓解治疗方案(3+7方案和3+10方案)治疗儿童急性髓系白血病(AML)的疗效。方法回顾分析2010年1月至2015年1月接受化疗的AML患儿100例,按入院时间分别接受3+7方案(AML-06方案,A组)和3+10方案(改良AML方案,B组),比较两组的疗效及不良反应。结果 A组56例,男31例、女25例,中位年龄8.2岁(全距1.0~13.0岁),FAB分型,M1型5例、M2型25例、M4型11例、M5型10例、M6型2例、M7型3例;B组44例,男26例、女18例,中位年龄9.3岁(全距1.4~12.5),FAB分型:M2型17例、M4型14例、M5型9例、M6型2例、M7型2例。A组首疗诱导完全缓解(CR)率为48.2%低于B组首疗完全缓解率(70.4%),两组间差异有统计学意义(P0.05)。B组的骨髓抑制期较A组长,诱导化疗后中性粒细胞数、血红蛋白、血小板恢复时间也均较A组长,差异均有统计学意义(P均0.05)。A组化疗相关死亡率1.8%,B组为2.3%,差异无统计学意义(P0.05)。A组3年总生存率为75.0%,B组总生存率为86.4%,差异有统计学意义(P0.05)。结论两种治疗方案对AML均有效,3+10方案完全缓解率高,不良反应无明显增加。     

NB4细胞诱导分化过程中WT1(17AA+/-)剪接变异体表达的研究

目的探讨WT1(17AA /-)剪接变异体表达的改变与NB4细胞诱导分化的关系.方法建立了实时定量RT-PCR方法检测看家基因GAPDH、WT1基因及其WT1(17AA )剪接变异体的表达水平,以同一份标本(WT1拷贝数/GAPDH拷贝数)×104来计算WT1表达水平,定义为WT1N(normalized WT1 expressionlevel),同样定义WT1(17AA )N,并用流式细胞仪检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化.结果随着NB4细胞向粒系终末分化WT1基因及其WT1(17AA )剪接变异体的表达水平迅速下降,全反式维甲酸(ATRA)作用0,6,12,18,24,48,72 h后WT1N的平均表达水平分别为191.11,121.17,66.72,43.47,18.29,4.04和3.79,WT1(17AA )N剪接变异体的表达水平分别为105.12,46.89,20.50,10.38,8.85,2.16和1.92,两者均与CD11b的变化呈负相关(r=-0.65,P＜0.01;r=-0.77,P＜0.01),而且值得注意的是在AT-RA作用后开始的18 h内,WT1(17AA )N/WT1N比值逐渐下降,24 h后与药物作用前水平无统计学差异,表明在ATRA诱导NB4细胞分化早期以WT1(17AA )剪接变异体表达下降为主.结论WTl基因高表达与NB4白血病细胞分化阻滞有关,WT1(17AA )剪接变异体可能在分化阻滞中起主要作用.     

肾母细胞瘤基因衍生肽诱导细胞毒性T淋巴细胞对白血病患者骨髓CD34+细胞的体外杀伤效应

目的 探讨肾母细胞瘤基因(WT1)衍生肽负载树突状细胞(DC)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对白血病CD34+细胞的体外清除效应.方法 合成一段针对HLA-A*0201锚位的WT19聚肽,体外负载来源于HLA-A*0201*健康人的DC后,诱导产生WT1肽特异性CTL(A组),以噻唑盐(MTT)比色法观察其对WT1表达阳性白血病患者(HLA-A* 0201+者3例,HLA-A*0201-者3例)骨髓CD34+细胞、健康人(HLA-A*0201+者2例,HLA-A*0201-者1例)外周血CD34+细胞和白血病NB4、K562及U937细胞株的体外杀伤效应,粒细胞-巨噬细胞系集落形成试验观察其对白血病患者骨髓CD34+细胞和健康人外周血CD34+细胞粒细胞-巨噬细胞系集落形成单位(CFU-GM)形成的影响.设立单独DC诱导CTL(B组)和IL-2诱导T细胞(C组)作为对照.结果 在效靶比为20:1时,A组CTL对3例HLA-A*0201+白血病患者骨髓CD34+细胞和NB4细胞的杀伤活性(分别为55.3%±2.8%,67.1%±3.2%、49.4%±3.8%和55.0%±3.7%)明显高于对3例HLA-A*0201-白血病患者骨髓CD34+细胞、健康人外周血CD34+细胞及K562、U937细胞的杀伤活性(均<20%),并明显高于B组和C组CTL(均P＜0.01).2例HLA-A*0201+白血病患者骨髓CD34+细胞经A组CTL处理后CFU-GM集落相对形成率分别为17.8%±4.0%和20.8%±3.4%,明显低于经B组CTL处理后(分别为88.9%±3.4%和91.8%±5.7%,均P＜0.01);HLA-A*0201-白血病患者骨髓CD34+细胞、健康人外周血CD34+细胞经A组和B组CTL处理后CFU-GM集落相对形成率差异尤统计学意义.结论 WT1肽特异性CTL能够以HLA-1类抗原限制方式杀伤高表达WT1基因的白血病CD34+细胞,且能特异性抑制其CFU-GM集落形成,WT1基因的表达产物可以作为清除白血病CD34+细胞靶点.     

抗淋巴细胞球蛋白在儿童血小板无效输注中的应用

血小板输注是预防和治疗各种原因引起的儿童血小板减少和（或）出血的重要措施,但反复多次输注易导致血小板输注无效（platelet refractoriness,PTR）,严重影响治疗,甚至危及生命。解决PTR问题已成为临床输血治疗的一项重要课题。但到目前为止,尚无对人类白细胞抗原（HLA）-I类抗体阴性PTR的有效治疗方案。笔者结合1例HLA-I类抗体阴性PTR的治疗,对抗淋巴细胞球蛋白（ALG）在PTR中的应用报道如下。     

髓系白血病细胞DNA非同源末端连接能力的检测

DNA双链断裂(double-strand break,DSB)是最致命的DNA损伤,在人类DSB最主要的修复方式是非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)[1].大部分DNA损伤都能修复,不能修复或不恰当的修复会造成基因变异、肿瘤发生和细胞死亡.     

单倍体供者与HLA相合供者HSCT治疗儿童MDS的疗效和安全性对比

目的 评价单倍体供者移植作为替代方案用于异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗儿童骨髓增生异常综合征(MDS)的疗效及安全性。方法 对2013年4月1日—2022年8月30日至苏州大学附属儿童医院接受allo-HSCT的22例儿童进展型MDS进行回顾性分析,其中全相合移植6例,单倍体移植16例。结果 22例患儿均实现中性粒细胞植入,全相合组和单倍体组中性粒细胞植入中位时间分别为移植后11(10～12)天和11(9～17)天,血小板植入中位时间分别为移植后11(8～16)天和12(7～28)天。两组aGVHD的发生率分别为50%和100%(P=0.013),Ⅱ～Ⅳ度aGVHD发生率分别为0%和81%(P=0.001),aGVHD发生时间、Ⅲ～Ⅳ度aGVHD、cGVHD、广泛型cGVHD发生率无统计学意义。单倍体组移植后围植入综合征发生率为81%,显著高于全相合组的17%(P=0.011)。全相合组和单倍体组在CMV血症、EBV血症、出血性膀胱炎、肺部感染及神经系统并发症发生率上差异无统计学意义。至随访截止日期,全相合组中位随访时间为20.82(8.00～68.00)个月,单倍体组...     

利用SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR方法检测白血病患者RbAp46基因的表达

目的探讨白血病患者骨髓细胞RbAp46基因的表达水平.方法建立实时定量RT-PCR方法,利用SYBR Green Ⅰ染料检测140例急性白血病(AL)、13例慢性粒细胞白血病(CML)慢性期和7例CML急变期患者以及32例非白血病患者骨髓细胞RbAp46基因的表达水平.结果初诊与复发AL患者骨髓中RbAp46基因表达水平的M估计值分别为178.23和213.65,明显高于完全缓解组和对照组(分别为85.89和88.08);CML慢性期组M估计值为58.27,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),而CML急变期组M估计值为173.24,明显高于CML慢性期组和对照组.98例初诊AL中除M2、M4亚型M估计值(62.63,130.67)与对照组相比差异无统计学意义外,余均明显高于对照组.初诊AL中RbAp46基因表达水平与bcr/abl、PML-RARα、mdrl基因的表达无相关性,但与WT1基因的表达水平呈正相关,与AML1/ETO融合基因表达呈负相关.结论RbAp46在AL初诊、复发及CML急变期患者骨髓细胞中高表达,可能参与白血病的发生.     

WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性研究

本研究探讨WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性,为开展基于WT1基因调控的白血病基因治疗奠定基础。以EGFP做报告基因,构建含有WT1基因启动子和增强子的重组表达载体;利用脂质体和电穿孔技术将重组质粒转染13个细胞株,包括WT1基因高表达的白血病细胞株(K562、NB4、THP-1、SHI-1),WT1基因低表达的白血病细胞株(U937和Jurkat);非造血细胞株中WT1基因高表达的MCF-7、T47D、293株细胞和WT1基因低表达的ECV304、SMMC7721、HT-29、SHG44细胞株;利用流式细胞术检测转基因细胞稳定表达EGFP的平均荧光强度。以平均荧光强度代表启动子和(或)增强子的转录活性。结果表明:通过基因重组技术构建了含有WT1基因启动子的表达载体pEWP,以及含有WT1基因启动子和增强子的表达载体pEWPA。就启动子的转录活性而言,在非白血病细胞株中,ECV304细胞EGFP的平均荧光强度最高,是空载体(pEGFP-1)的16.54±2.45倍,明显高于白血病细胞株(p<0.05);MCF-7和SHG44细胞次之,分别为9.46±1.10和7.29±0.73倍,HT-29细胞表达最低,仅为0.99±0.02倍。在人类血病细胞株中,K562细胞EGFP的平均荧光强度最高,是空载体pEGFP-1的2.93±0.27倍,明显高于Jurkat和SHI-1细胞株(p<0.05)。后二者分别为0.74±0.03和0.84±0.09倍。pEWPA可以使HT-29、SHI-1和K562细胞中WT1基因启动子的转录活性增强,分别增强到4.81、3.06和1.01倍。结论:WT1基因启动子的转录活性与细胞内在WT1基因的表达水平不相关,增强子增强部分细胞株中WT1基因启动子的转录活性,但不具有造血组织特异性。     

脐带间充质干细胞治疗儿童异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病疗效观察

本研究观察人脐带间充质干细胞（MSC）治疗儿童急性移植物抗宿主病的疗效和安全性。用胶原酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,进行传代培养、扩增,培养至第3-5代用于临床治疗;5例急性白血病患儿经化疗达完全缓解。2例行亲缘HLA3/6位点相合的骨髓造血干细胞移植,1例行同胞HLA全相合骨髓与外周血造血干细胞联合移植,1例行无血缘关系HLA4/6位点相合双份脐血造血干细胞移植,1例行无血缘关系HLA5/6位点相合单份脐血造血干细胞移植。患儿发生Ⅲ-Ⅳ度急性移植物抗宿主病（aGVHD）,接受二线免疫抑制治疗无效后,行0.5×106/kg受者体重MSC治疗。结果表明,5例急性白血病患儿均获造血重建,并发生皮肤、肝脏和胃肠道Ⅲ-Ⅳ度aGVHD,经二线免疫抑制治疗无效,输注人脐带间充质干细胞治疗后,皮疹消退,肝功能恢复正常,胃肠道症状好转。患儿均未发生输注相关不良反应。目前患儿均无原发病的复发,均处于无病生存状态。结论：异基因造血干细胞移植是治疗儿童急性白血病的有效方法,脐带间充质干细胞治疗儿童急性移植物抗宿主病是安全有效的。