HIV-1 Vpr蛋白对C8166细胞毒性研究

目的 利用腺病毒系统研究HIV-1 Vpr蛋白在T细胞来源的C8166细胞内的高表达以及细胞内该蛋白对T细胞毒性.方法 将表达目的 蛋白Vpr的重组腺病毒rAd-vpr和空白载体病毒rAd-vector分别感染对数生长期的C8166细胞,流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布、凋亡和坏死.用Hoechst-PI荧光染色观察细胞的凋亡和坏死,JC-1荧光染色测定线粒体膜电势.结果 Annexin V-PI染色及Hoechst-PI染色一致显示HIV-1 Vpr能显著诱导C8166细胞凋亡和坏死;PI细胞周期结果表明HIV-1 Vpr能阻滞C8166细胞于G2期;JC-1荧光染色法测定HIV-1 Vpr致C8166线粒体膜电势下降.结论 细胞内HIV-1 Vpr介导的T细胞毒性包括线粒体功能障碍、细胞周期的G2期阻滞和细胞的死亡.     

穿琥宁粉针剂体外抗HIV-1作用

目的: 探讨穿琥宁粉针剂在体外是否具有抗HIV作用. 方法:采用荧光染料Calcien AM标记HIV感染的慢性H9细胞(H9/HIV-1ⅢB)与不同稀释浓度的穿琥宁药物作用后,与靶细胞MT-2细胞混合培养,观察MT-2和H9/HIV-1ⅢB融合细胞的变化;MTT法检测穿琥宁对HIV感染细胞的保护作用;HIV-1P24抗原试剂盒检测药物作用后的细胞培养上清P24抗原含量的变化. 结果:穿琥宁粉针剂能够抑制MT-2和H9/HIV-1ⅢB细胞融合(其抑制融合的EC50为5.49 mg/L,选择指数SI为327.6);能够保护HIV感染细胞的死亡(EC50为64.57 mg/L,SI为27.85)和减少HIV-1 P24抗原的表达(EC50为194.67 mg/L,SI为9.23). 结论:穿琥宁粉针剂在体外具有抗HIV-1的作用.     

青藤碱对T淋巴细胞活化及TH1类细胞内细胞因子表达的影响

目的：深入研究青藤碱对T淋巴细胞Thl类细胞因子表达的影响。方法：分离小鼠淋巴结细胞，加入不同浓度的青藤碱作用1小时后，加多克隆刺激剂PDB和离子霉素，继续培养4小时后收获细胞，进行细胞内细胞因子染色，以流式细胞术对T细胞Th1类细胞因子TNF-γ、炎症性细胞因子TNF-α分子表达情况进行分析；同时，观察药物对T细胞活化早期标志CD59表达的影响；结果：1000μmol／L(329．24μg/ml)青藤碱能够抑制CD69表达，200μmol/L青藤碱对CD69表达无影响；200、1000、2000μmol／L青藤碱能够剂量依赖性地显著降低T细胞内细胞因子TNF-γ、TNF-α分子表达。结论：抑制T细胞活化异常可能是青藤碱治疗类风湿关节炎免疫药理机制之一，此抑制效应可能主要不是通过影响PKC而是与影响钙离子依赖的T细胞活化信号传导途径相关。     

VEGF诱导血管内皮细胞产生H2O2及其促增殖作用

目的： 研究VEGF诱导血管内皮细胞产生细胞外H₂O₂及其在VEGF促血管内皮细胞增殖功能中的作用。方法: ① 以H₂DCFDA为H₂O₂指示剂，检测 500 μg/L VEGF刺激下，血管内皮细胞H₂O₂的产生；② 以MTT法检测3×10⁶ U/L过氧化氢酶（CAT），及外源性加入5-20 mmol/L H₂O₂对VEGF促增殖功能的影响。结果: ① 在VEGF刺激血管内皮细胞 15 min 后，细胞内开始出现逐渐增强的荧光，且随时间逐渐增强，至 45 min 左右最强，随后逐渐减弱；而同时加入过氧化氢酶组的细胞则仅有微弱荧光产生，且荧光强度不随时间变化；② 3×10⁶ U/L过氧化氢酶对VEGF的促增殖功能有明显的抑制作用（P<0.01）；③ 外源性加入5-10 mmol/L H₂O₂ 时对血管内皮细胞有明显促增殖作用（P<0.01），但其对VEGF的促增殖功能却有显著抑制作用（P<0.01）。结论: VEGF可刺激血管内皮细胞产生细胞外H₂O₂，在促细胞增殖中可能具有重要作用。而外源性H₂O₂对VEGF的生理功能可能具有抑制作用。     

α-SMA的表达与软骨细胞的去分化

目的:探讨细胞骨架蛋白α-SMA的表达与软骨细胞去分化之间的联系.方法:分离、培养大鼠肋生长板软骨细胞(RGCs),对原代至第5代RGCs进行细胞生长动力学分析,阿尔新兰染色、免疫细胞化学法和蛋白质印迹分别检测蛋白多糖,α-SMA和Ⅱ型胶原的表达.结果:随着传代次数的增加,前3代RGCs的每日倍增指数逐渐增加,随后不断下降.原代RGCs的阿尔新兰和Ⅱ型胶原染色均呈强阳性,仅个别细胞α-SMA弱阳性染色.随着传代次数的增加,阿尔新兰和Ⅱ型胶原阳性染色的细胞比例迅速下降,第3代以后的RGCs阿尔新兰染色均为阴性,第5代RGCs也仅有圆形细胞仍保持了Ⅱ型胶原阳性染色,而α-SMA阳性染色细胞的比例则不断增加.蛋白质印迹所揭示的Ⅱ型胶原和α-SMA蛋白表达的变化趋势与免疫细胞化学染色的结果一致.结论:α-SMA从无到有并随着RGCs去分化程度的增强而增加的表达模式,提示它是引起软骨细胞"去分化"的重要原因.     

地塞米松介导胸腺细胞凋亡过程中线粒体和细胞结构蛋白的变化

目的：研究地塞米松(DEX)介导的小鼠胸腺细胞凋亡过程中线粒体质量和结构蛋白变化特点。 方法： 以地塞米松（DEX）诱导小鼠胸腺细胞凋亡为模型，利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术研究细胞凋亡和坏死，JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电势（△Ψm）和线粒体质量，利用CFDA-SE染色流式细胞术检测细胞结构蛋白变化。 结果： 在1×10-6mol/L DEX诱导下，小鼠胸腺细胞在6 h凋亡比率为(51.25±5.51)%，对照组为(12.03±2.00)%，差异显著（P<0.01）； DEX组坏死比率为(30.25±3.67)%，对照组为(10.11±1.11)%，差异显著（P<0.01）。DEX组在6h时点的线粒体质量显著低于对照组（P<0.01），FL1平均荧光强度分别为（561.62±54.27）和（900.25±38.80）。DEX同时引起线粒体膜电势的显著下降（P<0.01），对照组FL2平均荧光强度为（267.51±26.48），DEX组为（133.17±12.29）。成熟T细胞培养48 h，CFDA-SE法仅检测到亲代单一细胞峰；而在Con A刺激条件下出现3个子代峰。对照组小鼠胸腺细胞在CFDA-SE染色培养6 h条件下，存在(5.25±1.15)％的低荧光强度细胞群，而在DEX刺激下，该群细胞占（47.39±9.76）％，并且在直方图结果上形成明显的细胞峰。 结论： DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程中，线粒体质量和细胞结构蛋白均有所下降；CFDA-SE染色流式细胞术可以作为基于细胞结构蛋白变化的凋亡定量检测方法。     

人类巨细胞病毒特异性CD8+ T细胞IFN-γ和穿孔素水平的检测

目的研究人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽(pp65495-503, NLV)特异性CD8+ T细胞的功能特性.方法将HLA-A2/NLV四聚体染色与细胞内细胞因子或穿孔素染色相结合,以流式细胞仪直接分析NLV特异性CD8+ T细胞内穿孔素的表达水平,或者在NLV抗原肽刺激6 h后分析γ-干扰素(IFN-γ)的表达水平.结果 NLV抗原肽能诱导hCMV特异性CD8+ T细胞分泌IFN-γ,不同供者特异性CD8+ T细胞产生IFN-γ的比率存在较大差异(55.69±17.64) %,当NLV抗原肽质量浓度为10 μg/mL时IFN-γ阳性细胞百分率最高;未经刺激的特异性CD8+ T细胞内表达较高水平的穿孔素(53.90±16.41)%.结论识别单一表位的hCMV特异性CD8+ T细胞合成IFN-γ和穿孔素的能力存在多样性.     

脐血和外周血单个核细胞培养上清影响HIV-1感染的体外实验研究

目的：体外研究脐血和外周血单个核细胞（CBMC和PBMC）培养上清对HIV-1感染的影响，为发现抗HIV-1的可溶性因子奠定基础。 方法： PHA刺激CBMC和PBMC后5 h和12 h收集上清，加入荧光标记的HIV-1ⅢB/H9和MT-2细胞培养体系中，2 h后在倒置荧光显微镜下观察其对细胞融合的影响；用Luminex 100TM分析仪检测收集上清中细胞因子含量。 结果： PHA刺激CBMC和PBMC后5 h和12 h的上清均可抑制HIV-1ⅢB/H9和MT-2细胞融合，同一时间收集的PBMC和CBMC上清对HIV-1ⅢB/H9和MT-2细胞融合的抑制作用无差异，但5 h上清的抑制作用强于12 h的上清；CBMC 5 h上清中促炎症细胞因子比PBMC 5 h上清为低，而CCR5配体MIP-1α和RANTES则比PBMC 5 h上清高，差异显著（P＜0.05）。 结论： 通过脐血和外周血单个核细胞可以制备有效抗HIV感染的可溶性因子，可能为艾滋病治疗药物提供新的来源。     

麒麟菜中蕨藻红素抗肿瘤活性研究

目的：探讨把蕨红藻素（caulerpin）发展成为抗肿瘤药物的可能性。方法：检测caulerpin对细胞株HL60的细胞毒作用及诱导细胞凋亡作用。结果：Caulerpin对HL60细胞有一定的细胞毒和细胞诱导凋亡作用。结论：Caulerpin具有发展成为抗肿瘤药物的可能性。     

人胎盘绒毛提取物体外对T细胞应答的抑制效应

目的:了解胎盘绒毛对T细胞应答的抑制能力及其在妊娠周期不同阶段的变化. 方法:制备孕10,20和37 wk的绒毛提取物,通过检测CD69和CD25分子的表达,评价其对T细胞活化的影响,WST-1法分析其对T细胞增殖的影响,流式微球阵列(CBA)法分析其对Th1/Th2细胞因子谱的影响,并以Western印迹法分析提取物中吲哚胺-2,3双加氧酶(IDO)的含量. 结果:孕早、中、晚期的胎盘绒毛提取物均能显著抑制植物血凝素(PHA)诱导的人T细胞活化,增殖,细胞因子分泌以及ConA诱导的小鼠T细胞活化(P<0.01). 但三个时期的提取物对上述不同T细胞行为的抑制强度不同,以20 wk提取物的抑制作用最强. 提取物中IDO蛋白的含量20 wk最高,37 wk次之,10 wk最低. 结论:妊娠不同时期的绒毛滋养细胞均能够抑制T细胞应答,但抑制强度不一致,且对T细胞不同行为的抑制存在分离现象,提示妊娠不同时期的绒毛滋养细胞表达抑制因子的模式不同.