ING4基因的克隆及其诱导HeLa细胞凋亡的实验研究

 目的：分离小鼠ING4基因并构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4, 观察ING4基因转染人宫颈癌HeLa细胞后对细胞凋亡的影响。方法:应用RT-PCR技术从小鼠肝组织中扩增得到ING4cDNA。利用DNA重组技术构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4并用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定,然后利用阳离子脂质体lipofectamine将其转染HeLa细胞，用RT-PCR检测ING4基因的表达情况，应用荧光显微镜（Hoechst33258染色）、激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪观察细胞凋亡情况。结果:RT-PCR产物为约 750 bp 的条带,构建的真核表达载体pcDNA3.0-ING4经双酶切、PCR鉴定均出现 750 bp 大小的条带，基因测序正确, Hoechst33258染色发现pcDNA3.0-ING4转染HeLa细胞的凋亡率（21.25%）明显高于对照组pcDNA3.0转染HeLa细胞的凋亡率（8.91%,P<0.01）。共聚焦显微镜也观察到了典型的细胞凋亡。细胞周期检测显示S期细胞所占百分数pcDNA3.0-ING4转染组高于pcDNA3.0转染组。结论:分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4, 初步研究发现该基因转染HeLa细胞后可促使细胞凋亡。     

中药有效成分在IFN-α、IL-2促诱生技术中基础及其应用性研究

中草药是我国传统医药中的宝贵财富,补气类中药有补气、益精,扶正固本的功效,在强身健体中已获得广泛应用,但其药效的分子机理仍有待于进一步研究。本项研究是采用刺五加甙及其多糖,     

血管生成素1基因重组腺病毒载体的构建及其促血管形成作用

目的 构建携带人血管生成素1(Ang-1)基因的腺病毒表达载体,并观察其感染QBI-293A靶细胞后目的基因的表达及其促血管新生的效应。方法 以骨髓细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增Ang-1基因片段,于BglⅡ、Sal Ⅰ酶切位点亚克隆至pAdTrack-CMV,构建pAdTrack-CMV-Ang-1重组转移质粒。然后pAdTrack-CMV-Ang-1重组转移质粒与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒同源重组后,再经QBI-293A细胞包装、扩增和纯化获得高滴度的Ad-Ang-1重组腺病毒。RT-PCR和ELISA检测腺病毒介导的外源性Ang-1基因在QBI-293A细胞中的转录和表达。将鸡胚随机分成3组：Ad-Ang-1重组腺病毒组、Ad空载体腺病毒组、生理盐水(NS)组,观察鸡胚绒毛膜尿囊膜(CAM)新生血管形成。结果获得了高滴度的Ad-Ang-1重组腺病毒,其病毒效价可达3×1010 pfu/ml。Ad-Ang-1感染后,QBI-293A细胞中的Ang-1含量(47522.53±3685.57) ng/L较QBI-293A细胞对照组(2490.86±550.95) ng/L和Ad空病毒感染组(2323.20±260.55) ng/L均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01)。Ad-Ang-1重组腺病毒组有效地促进了二、三级分支血管的生成。结论 成功获得了携带人Ang-1基因的腺病毒表达载体,为进一步开展Ang-1基因修饰干细胞的应用研究奠定了实验基础。     

rhLIF与IL-24基因协同诱导HL-60细胞的凋亡

目的：构建能稳定表达白血病抑制因子（LIF）的转基因细胞,并研究所表达的LIF与IL-24基因在诱导HL-60细胞凋亡方面的协同作用。方法：用真核表达质粒pcDNA3-LIF转染ECV304细胞,G418筛选阳性细胞,收集阳性细胞和培养上清,RT-PCR检测LIFmRNA的表达。同时在已转化重组腺病毒质粒的大肠杆菌中抽提质粒pAdEasy-1-pTrack-CMV-IL-24,用PacI酶切使重组腺病毒质粒线性化,脂质体转染QBI-293A细胞,收获Ad-IL-24腺病毒子。将重组病毒子（Ad-IL-24）感染HL-60细胞,同时加入含LIF的培养上清,并设对照组,RT-PCR检测IL-24 mRNA表达,光镜下观察HL-60细胞形态的变化,激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫细胞化学分析凋亡因子的改变。结果：成功构建能稳定表达LIF蛋白的转基因细胞;获得高滴度的重组腺病毒Ad-IL-24,用它感染HL-60细胞后,能检测到IL-24 mRNA的表达。各种检测方法表明LIF、IL-24基因都能抑制HL-60细胞生长、诱导凋亡,且两者具有协同作用。结论：LIF、IL-24基因都能抑制HL-60细胞生长,诱导凋亡,两者具有协同作用。     

刺五加多糖对白血病细胞系促诱生干扰素的动力学研究

剌五加[Acanthopanax Senticosus (Rupr et Maxin)Harm]是祖国医学中常用的“补中、益精”、“补气”的中草药。近年来,国内外对剌五加进行了大     

Caspase抑制剂对缺氧诱导的心肌细胞凋亡及相关基因表达的影响

目的 探讨Caspase-3特异性抑制剂在缺氧诱导的培养乳鼠心肌细胞凋亡中的作用及其相关基因的表达。方法 将SD乳鼠的培养心肌细胞随机分为对照组、缺氧72 h组及Caspase-3抑制剂组（缺氧72 h前加入0.1μmol/L的Z-DEVD-fmk）3组。应用Western blot分析法和RT-PCR技术检测Caspase-3、PARP蛋白及Caspase-3mRNA的表达,同时利用流式细胞仪分析心肌细胞凋亡的变化;借助Caspase-3荧光分析试剂盒,荧光比色法检测心肌细胞凋亡过程中Caspase-3活性的变化。结果 Caspase-3抑制剂组细胞凋亡百分率为（14.93±2.47）%,显著低于缺氧72 h组的（48.43±4.18）%,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。Caspase-3抑制剂组PARP及Caspase-3蛋白表达显著低于缺氧72 h组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。RT-PCR分析显示,Caspase-3抑制剂组Cas-pase-3 mRNA的表达量较缺氧72 h组降低了62.05%,差异有高度统计学意义,Caspase-3活性检测显示,Caspase-3抑制剂组的Caspase-3活性较缺氧72 h组降低了52.85%,差异有高度统计学意义（均P〈0.01）。结论 Caspase-3抑制剂能明显抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡、Caspase-3蛋白和mRNA的表达、Caspase-3蛋白酶活性和PARP的裂解。     

丝素蛋白材料细胞相容性的研究

目的：研究再生丝素膜对大鼠真皮细胞生长和细胞遗传学的影响。方法：采用静置贴壁培养法在再生丝素膜上培养大鼠真皮细胞，并用活细胞计数法和常规染色体检测技术，观察再生丝素膜对细胞生长和染色体的影响。结果 再生丝素膜能支持细胞正常生长，呈现正常的生长繁殖曲线且染色体的形态和数目正常。结论 再生丝素膜对大鼠真皮细胞具有良好的细胞相容性。     

ING4基因真核表达载体的构建及其功能

目的：构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,观察ING4基因对人肝癌SMMC7721细胞周期及凋亡的影响。方法：小鼠肝组织经RT-PCR扩增,构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,分别用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定,将其转导进入人肝癌SMMC7721细胞,检测ING4基因的表达情况及其对细胞周期的影响,应用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。结果：RT-PCR产物为约750bp的条带,基因测序正确,转导进入人肝癌细胞株SMMC7721后可延长G2期,其凋亡率（23.66％）明显高于对照组（13.75％）。结论：成功分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,该质粒转染人肝癌SMMC7721细胞后可延长G2期并可促使细胞凋亡。     

双黄连粉针剂抗柯萨奇病毒B3型效应的实验研究

目的：探讨双黄连在体外抗柯萨奇病毒（ＣＶＢ３）的效应。方法在Ｗｉｓｈ细胞上采用微量细胞病变抑制法。结果（１）３．０ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ双黄连均可直接杀伤１００、１０ＴＣＩＤ５０病毒,且３．０ｍｇ／ｍｌ直接灭活ＣＶＢ３的产应明显。（２）０．５、０．２５、０．１２５ｍｇ／ｍｌ双黄连可分别阻断１００、１０、１ＴＣＩＤ５０病毒吸附细胞。（３）１．５、０．２５、０．２５ｍｇ／ｍｌ双黄连可分别抑制１０     

mING基因的腺病毒载体的构建与表达

目的构建鼠ING4（肿瘤生长抑制因子4）的腺病毒载体，获得鼠ING4（mING4）重组腺病毒子，为ING4进行肿瘤的基因治疗奠定基础。方法以pcDNA3．0-mING4重组质粒为模板，PCR扩增miNG4，酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack-CMV质粒上，PmeI线性化重组质粒pAdTrack-CMV-mING4，与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒表达载体pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-mING4，经PacI线性化后转染293细胞，收获腺病毒重组病毒子，RT-PCR鉴定，并用MTT法检测mING4对肝癌细胞SMMC7721的作用。结果成功构建mlNG4的重组腺病毒表达载体pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-mING4，获得了mING4重组病毒子。结论mING4的重组腺病毒表达载体可抑制SMMC7721细胞的生长。