IFN-αAd3病毒诱导抗病毒蛋白MxA表达的研究

ＭｘＡ蛋白是一种干扰素 (ＩＦＮ)诱导的新型蛋白。本研究拟以不同诱导物诱导、从不同浓度、不同时间来探讨ＭｘＡ蛋白的表达。1　材料和方法1 1　材料　人胚肺ＷＩ 38细胞为本院基因室保存 ;ＰＢＭＣ来自苏州市中心血站健康成年人外周血 ;腺病毒 3型(Ａｄ3)为我院基因室保存 ,ＴＣＩＤ50 为 10 -5/ｍｌ;ＩＦＮ α 2ｂ为安徽安科生物高技术公司生产的安达芬 (10 0万ＩＵ/ｍｌ) ,批号 :980 918;山羊抗人ＭｘＡ蛋白多抗由Ｄｒ ＭＡ Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ(ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｏｒｅＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ…     

人抑瘤素M基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人Oncostatin M（OSM，抑瘤素M）基因的逆转录病毒载体。方法用DNA重组技术，以pcDNA3．1finyc-his（-）A-hOSM重组质粒为模板PCR扩增人OSM基因，酶切连接到带有GFP标记的逆转录病毒载体pEGZ／MCS．HA上，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，抽提质粒，用PCR法、限制性内切酶EeoRI和BamHI双酶切法及测序鉴定。然后以脂质体转染法，将重组的逆转录病毒载体与辅助质粒HIT456、HIT60共同转染入包装细胞系293T以包装病毒。结果构建了重纽人抑瘤素M基因逆转录病毒载体，PCR产物电泳可见约750bp处有特异性条带，EcoRI和BamH，双酶切，电泳出现两个条带，约750bp处亦有相应条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的人抑瘤素M基因的CDS序列完全一致。转染293T细胞在倒置荧光显微镜下可见绿色荧光，且细胞有病变。提示构建携带人OSM基因的逆转录载体成功。结论携带人抑瘤素M基因的重组逆转录病毒载体pEGZ／MCS-HA-hOSM成功构建为此基因的临床应用和实验研究奠定了基础。     

Ad-hIL-24体外诱导喉癌细胞Hep-2的凋亡作用

目的研究腺病毒介导的人白细胞介素-24（hIL-24）基因选择性诱导喉癌细胞Hep-2凋亡的作用。方法将携带有hIL-24基因的重组复制缺陷型腺病毒（Ad-hIL-24）感染喉癌细胞Hep-2,并以人胚肺成纤维细胞WI-38为对照,采用RT-PCR法检测Hep-2、WI-38细胞中外源性hIL-24基因表达;采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）及流式细胞术等方法检测细胞的生长和凋亡情况。结果腺病毒介导的hIL-24基因能在Hep-2细胞和WI-38细胞中表达;MTT法显示Ad-hIL-24能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长,LSCM观察结果表明Ad-hIL-24能促进喉癌细胞Hep-2凋亡,流式细胞术显示Hep-2细胞经Ad-hIL-24感染48h后凋亡率为18.47%,G2/M期细胞百分比为38.9%,显著高于PBS组、Ad-GFP组和WI-38细胞,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论Ad-hIL-24能抑制喉癌细胞Hep-2生长和诱导Hep-2细胞凋亡,但对正常细胞无毒性作用。     

Ad-IL-24诱导U87-MG人脑胶质瘤细胞凋亡的研究

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,约占所有脑肿瘤的50%,目前多采用手术、放疗及化疗等常规疗法,但大部分患者预后不佳[1].我们利用已构建的腺病毒介导白细胞介素-24(IL-24)基因表达载体(Ad-IL-24),观察其对U87-MG人脑胶质瘤细胞的生长抑制和凋亡作用,并探讨其分子机制.     

RMP基因在体内对肝癌细胞株SMMC-7721的生长抑制作用

目的探讨RMP基因在体内抑制肿瘤细胞生长的作用及其机制。方法通过体外构建真核表达载体pGPU6-Neo-RMP-484、pFLAG-CMV-4-RMP以及稳定表达细胞株shRNA-SMMC-7721、RMP-SMMC-7721,并测定RMPmRNA表达的变化,荷瘤裸鼠皮下注射各组肝癌细胞,观察移植瘤的大小及病理变化。结果成功构建了真核表达载体及稳定表达细胞系。实验组移植瘤体积、质量、病理及肿瘤相关蛋白的表达量均有明显变化。结论RMP基因在体内能有效地抑制肝癌细胞的生长,为RMP对肝癌的基因治疗/基因干预提供了有价值的靶点及体内分子机制的实验依据,为深入研究奠定了基础。。     

人白细胞介素-18的基因克隆及原核表达

目的　为进一步研究人白细胞介素 (hIL - 18)的生物学特性打下基础 ,进行hIL - 18的基因克隆及原核表达。方法　采用反转录PCR(RT -PCR)法从正常人外周血白细胞中克隆hIL - 18基因 ,并重组于PBV2 2 0表达载体上 ,经酶切初步鉴定后进行DNA序列分析 ,继而观察重组hIL - 18基因在大肠杆菌中不同诱导时间表达量的差异。结果　所克隆的基因与预期结果一致 ,并在 42℃诱导 5h时表达量最高。结论　成功地克隆了hIL - 18基因 ,并使获得高效表达     

大鼠同种异体心脏移植免疫耐受的特异性实验研究

目的：研究大鼠同种异体心脏移植免疫耐受的特异性。方法：建立大鼠异位心脏移植模型,应用抗淋巴血清（ALS）及／或胸腺内注射脾细胞抗原预处理受体,21天后进行心脏移植,经过心脏移植并产生免疫,耐受的受体鼠在心脏移植60天后再次接受供体鼠的皮肤移植。结果：同时应用ALS及胸腺注射脾细胞抗原组的移植心平均存活时间较其它组显著延长（平均＞72天）,移植的皮肤在移植心耐受组中平均存活7．4天即被排斥,这与未处理组的皮肤移植无判别,但移植皮肤的排斥并不影响移植的心脏。结论：同种异体心脏移植产生的特异性免疫耐受是胸腺内注射供体脾细胞和腹腔注射ALS共同作用的结果。胸腺预注射供体脾细胞并腹腔注射ALS诱导产生的免疫耐受有器官特异性及组织特异性,。     

榄香烯体外诱导急性白血病细胞凋亡的研究

目的 探讨榄香烯诱导白血病细胞凋亡的作用及其机制。方法 采用MTT法、荧光显微镜、透射电镜、流式细胞术（FCM）、DNA电泳方法观察榄香烯对HL．60白血病细胞株的促凋亡作用，并进行细胞周期分析和采用RT-PCR、FCM检测bcl-2基因表达的变化。结果 榄香烯在体外诱导HL-60细胞凋亡，呈细胞凋亡典型的形态和生化特征，可见凋亡小体和梯形条带，并具有时间剂量依赖性，凋亡率最高达51．8％，在凋亡过程中细胞阻滞于S期，并检测到bcl-2基因表达下调。结论 榄香烯具有诱导细胞凋亡的作用，其机制可能与bcl-2基因表达下调有关。     

ING4的原核表达及多克隆抗体的制备

目的在原核系统中表达并纯化ING4蛋白，制备多克隆抗体。方法构建表达载体pET-21a（＋）-ING4，转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳检测。结果构建的表达载体pET-21a（＋）-hGDNF经酶切、PCR鉴定均出现750bp左右的条带，测序结果正确，用IPTG诱导转化菌有30KD大小的目的条带，表达的目的蛋白占菌体总蛋白10％以上，以包涵体形式存在，纯化后其纯度可达70％以上。用纯化的ING4蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结论制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。