腺病毒介导的PTEN对A549肺癌细胞体内外生长的影响

目的：研究携带第10号染色体缺失的磷酸脂酶和张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue-deleted chromosome ten gene，PTEN）的腺病毒表达载体对A549肺癌细胞体内外生长的抑制作用。方法：从人外周血淋巴细胞中通过RT—PCR扩增出PTEN基因片段，将其克隆到pAdTrack—CMV转移载体上，构建了PTEN重组腺病毒载体。体外用MTT法检测Ad—PTEN对A549肺癌细胞生长的抑制作用，以流式细胞术检测肿瘤细胞的周期和凋亡率。建立荷瘤裸鼠模型，体内检测Ad—PTEN对A549肺癌细胞移植瘤生长的影响，以免疫组化法检测移植瘤中微血管密度。结果：克隆的P陋Ⅳ基因测序结果与基因Bank数据库完全相符。Ad—PTEN体外感染A549肺癌细胞48h后其凋亡率为10．5％，明显高于对照细胞；4d后细胞生长与对照组细胞相比抑制了57％。肺癌细胞移植瘤治疗结束时，Ad—PTEN组瘤重为（0．58±0．29）g，对照组瘤重为（1．42±0．24）g，其生长抑制达59％（P〈0．05）；同时移植瘤中微血管密度降低约49％（P〈0．05）。结论：成功构建的Ad—PTEN腺病毒载体能在体内外抑制A549肺癌细胞及其移植瘤的生长。     

人IL-17F重组逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的稳定表达

目的构建hIL-17F重组逆转录病毒载体并研究它在293T细胞中的表达。方法以测序验证的pUCm-T/hIL-17F为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因片段(包括20aa信号肽序列,而且hIL-17F基因内EcoR I酶切位点GAA T TC→GAA C TC同义点突变,即AA T→AA C,均为Asn),并正向插入逆转录病毒载体pSIV-1后经PCR、双酶切和测序鉴定。将构建正确的pSIV-1/hIL-17F与辅助病毒载体pHIT456和pHIT60混合后,采用脂质体法共转染293T包装细胞,获得具有感染能力的成熟重组逆转录病毒感染293T细胞,经G418筛选获得阳性细胞株,并应用PCR、RT-PCR和dot-ELISA法检测hIL-17F目的基因在293T细胞中的整合、转录和表达。结果成功构建了hIL-17F基因内EcoRI酶切位点GAA T TC→GAA C TC同义点突变的重组逆转录病毒载体pSIV-1/hIL-17F,并在293T细胞中稳定表达。结论以逆转录病毒为载体感染的稳定表达rhIL-17F的293T转基因细胞株的首次获得,为进一步研究hIL-17F的生物学功能及其机制奠定了良好的基础。     

人脑源性神经生长因子(hBDNF)基因在CHO细胞的稳定表达及功能研究

目的将人脑源性神经生长因子（hBDNF）基因转染CHO细胞后,建立稳定表达体系,并检测培养上清中所表达的hBDNF的生物学活性。方法采用脂质体介导的真核细胞转染,运用RT-PCR,Western blot及MTT法进行检测分析。结果转染hBDNF基因的CHO细胞可表达hBDNF mRNA,上清中可检出hBDNF蛋白的存在,且此上清具有促进PC12细胞生长和分化的功能。结论成功地建立了hBDNF在CHO细胞中的稳定表达体系,转染hBDNF基因的CHO细胞所分泌的hBDNF蛋白具有较高的生物学活性,为进一步研究BDNF的生物学功能和开展生物治疗奠定了实验基础。     

rhIL-6对致死性辐射损伤小鼠早期造血功能恢复的实验研究

目的:本研究为观察rhlL-6对小鼠造血功能的影响。方法:应用致死性(?)Co-Y射线辐照BALB/c小鼠,造成骨髓型放射损伤模型。在照射后用rhIL-6皮内注射给药6天(2pg/Bid/只),通过检测出、凝血时间(BT、CT)、凝血酶原时间(PT)、外周血PLT和WBC,以及骨髓造血细胞体外培养CFU-Mix和脾脏CFU-S的数目,研究rhIL-6对骨髓型放射损伤小鼠早期造血功能恢复的效应,并进行机理的探讨。结果:rhIL-6处理组小鼠的BT、CT和PT均比对照组显著缩短(P<0.01),外周血PLT和WBC分别比对照组提高130％和165％,促进造血干/祖细胞(HSC/HPC)增殖、分化。骨髓造血细胞体外培养CFU-Mix和脾脏CFU-S计数均显著高于对照组(P<0.01)。结论:以上说明rhIL-6具有促进造血干/祖细胞(HSC/HPC)增殖,分化有利于受照小鼠早期造血细胞恢复的生物效应,可减轻辐射所致的骨髓造血功能的损伤。     

不同温度对HOS——8603细胞株的热灭活

目的：为了探索临床热灭活恶性骨肿瘤细胞的适宜温度。方法：应用MTT法测定SDH活性及肿瘤干细胞集落形成法对HOS-8603细胞株进行体外热灭活(42℃-50℃)实验研究。结果：45℃60min或50℃10min以上时，HOS-8036已基本失去细胞集落形成能力。SDH的活性随温度升高及时间延长面下降，与细胞集落形成能力有较好的相关性。结论；以上研究提示临床上无需采用煮沸方法．灭活温度在50℃左右即可将肿瘤细胞杀灭。     

rhIL-2对人骨髓CFU-GM与CFU-E和BFU-E的影响

目的:为了探索rhIL-2对人骨髓造血干祖细胞体外增殖的影响。方法:本文采用甲基纤维素体外半固体培养法。结果:证明了50～1000U/ml rhIL-2单用时对人骨髓造血祖细胞的CFU-GM、CFU-E及BFU-E无直接刺激增生作用,当与GM-CSF联合应用时,100～400U/ml rhIL-2其CFU-GM集落形成率明显高于单用GM-CSF(100U/ml)的对照组(P<0.05),当与EPO(2U/mi)联合应用时其CFU-E,及BFU-E集落形成率也明显高于单用EPO对照组(P<0.05),而1000U/ml rhIL-2其三种集落形成数目呈下降趋势,可能有抑制作用。结论:以上结果说明100～400U/ml rhIL-2可应用于协同GM-CSF及EPO体外扩增骨髓干/祖细胞来进行骨髓移植。     

人IL-17F融合蛋白在E.coli中表达及其生物学活性研究

目的：构建重组原核表达载体pCEX-5X-3／hIL-17F，使其在大肠杆菌中表达，获得GST-hIL-17F融合蛋白，并研究其生物学活性。方法：利用PCR法从自行构建的含hIL-17F基因的pUCm-T／hIL-17F载体中扩增其成熟肽基因序列，亚克隆于pGEX-SX-3中，构建原核表达载体pGEX-5X-3／hIL-17F，并在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达包涵体融合蛋白，经纯化后进行Western blot鉴定。MTT法分析GST-hIL-17F纯品蛋白对人脐静脉内皮细胞ECV304的生长抑制作用，EUSA法检测对ECV304内皮细胞表达IL-6、IFN-γ和TNF-α的生物学作用，并采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）法分析其对血管形成的影响。结果：GST-hIL-17F融合蛋白在大肠杆菌BL21中获得了高效表达，约占菌体总蛋白的55％，能产生约41kD的融合蛋白，且Western blot证实确为GST-hIL-17F目的蛋白。CST-ML-17F具有明显抑制ECV304内皮细胞增殖和上调表达IL-6的生物学效应，并具有显著的抗血管形成活性。结论：ML-17F重组原核表达和血管形成抑制效应的初步研究已获成功，为进一步研究rhIL-17F的抗血管形成机制和临床应用奠定了基础。     

几种丝素材料细胞毒性的实验研究

目的：研究不同交联方式的再生丝素膜(WL组，SD组，HY组)的细胞毒性及其影响细胞增殖的因素。方法：采用浸提液法，体外培养鼠胚真皮层纤维细胞，用MTT法检测细胞增殖活力和计算相对增殖率。结果：WL组，SD组再生丝素膜细胞毒性小于1级，有较强的增殖活力；HY组再生丝素细胞毒性0～2级；而用高浓度环氧交联剂交联的再生丝素膜对细胞生长有一定抑制作用；且随着环氧交联剂浓度的增加，细胞毒性增大。结论：WL组和SD组再生丝素膜无细胞毒性，HY组再生丝素膜无明显的细胞毒性，高浓度环氧剂交联的再生丝素膜对细胞有一定的毒性，有待于进一步改性。     

人骨髓基质细胞的长期培养及其对单纯疱疹病毒的敏感性

采用静置贴壁培养法,体外长期培养了胎儿、儿童和成人骨髓基质细胞,并将传至５代以上的肌样骨髓基质细胞采用微量细胞病变（ＣＰＥ）法,对单纯疱疹病毒进行了敏感性试验。结果：人骨髓基质肌样细胞对Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒均敏感,能产生明显的ＣＰＥ,其效价（ＴＣＩＤ５０）可达１０－３～１０－４,其中胎儿骨髓基质肌样细胞对病毒敏感性比儿童高２倍,比成人高４倍。提示此法可为人骨髓细胞体外长期培养提供简便方法,且为该细胞对病毒的敏感性提供实验依据,并为该细胞的利用开辟了新的应用前景。     

再生丝素膜对鼠胚真皮层成纤维细胞遗传特性的影响

目的 :研究再生丝素膜 (WL组 ,HY组 ,SD组 )对大鼠鼠胚成纤维细胞的遗传物质的影响。方法 :采用浸提液法在体外培养鼠胚成纤维细胞 ,计算细胞的微核率 (MNF)和染色体畸变率 (CAF) ,用单细胞电泳法 (SCGEassay)检测基因组DNA的损伤程度。结果 :WL组、SD组再生丝素膜和空白对照组的细胞微核率 (MNF)和染色体畸变率(CAF)无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,无明显彗星现象 ;而HY组再生丝素膜与阴性对照比较有显著差异 (P <0 0 1)。结论 :WL组和SD组再生丝素膜对种子细胞的遗传学特性无明显影响 ,优于HY组。