sCD40LIg重组腺病毒载体的构建鉴定和体外表达

目的构建含有分泌型人胞外区CD40L融合蛋白(sCD40LIg)基因的重组腺病毒载体,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础.方法分别以质粒pAdCTLA4Ig和pGEM-T-easy-sCD40L为模板,通过PCR扩增获得人源IgGFc和sCD40L基因全部序列.分别回收用连接酶连接,以连接产物为模板PCR,获得sCD40LIg基因全部序列,插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV的启动子下游BglⅡ及XhoⅠ位点之间,获得重组质粒pAdTrack-sCD40LIg.将正确重组体pAdTrack-sCD40LIg转化含腺病毒骨架质粒的pAdEasy-1-BJ5183细菌行同源重组.提取重组成功质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因,Western blot分析蛋白表达等方法鉴定重组的腺病毒.结果成功构建了含有sCD40LIg基因的重组腺病毒并在体外表达.结论该重组腺病毒的构建为下一步研究其在哺乳动物细胞内表达及在移植排斥的基因治疗中的作用提供了一定的基础.     

人CD40L胞外区腺病毒分泌表达载体的构建

目的 构建人CD40L胞外区单基因腺病毒分泌表达载体pAd—hCD40L，为进一步研究CD40，CD40L共刺激通路在免疫耐受中的作用奠定基础。方法 用PCR法分别扩增人CD40L胞外区和致瘤素的分泌信号肽cDNA，通过PCR连接后将重组的cDNA扩增出来，导人pGEMT-Easy，经测序正确后转入AdEasy(tm)XL Adenoviral Vector System系统中，得到CD40L胞外区单基因腺病毒分泌表达载体。结果 核苷酸序列测定显示克隆基因的核苷酸及推导的氨基酸序列与文献报道一致，开放阅读框正确。结论 人CD40L胞外区单基因腺病毒分泌表达载体构建成功。     

原位灌注肝肾联合快速切取方法的改进及临床应用

目的 探索适用于临床的肝肾联合切取方法。方法 在动物原位灌注肝肾联合快速切取实验研究的基础上，进行12例次肝肾联合切取，其中7例肝脏切取前未行灌注，5例实施原位灌注后肝肾联合快速切取。结果 成功获取可资利用的大器官27个，施行5例同种异体肝脏移植和22例肾移植。所切取的器官5例肝移植通血后10min内有金黄色的胆汁泌出，术后每日分泌胆汁约200mL;22例肾移植通血后1－10min内有尿液泌出，术后每日排出尿液约2000mL。结论 原位灌注肝肾联合快速切取是理想的临床供器官（肝、肾）切取方法，不仅充分利用了供体器官；而且可缩短热缺血时间，提高移植器官保存质量，降低器官的废弃率。     

肾移植受者HLA体液致敏因素

目的：探讨肾移植受HLA体液致敏的形成原因。方法：应用ELISA方法对199例（男133例,女66例）肾移植等候血中HLA抗体进行检测,分析与年龄、性别、透析时间、移植史、输血次数、妊娠史的关系。结果：HLA体液致敏的分布在女性组高于男性组（32％vs17％,P＜0．05）;在输血组高于无输血组（43％vs6％,P＜0．001）;在透析时间≥1a组高于透析时间＜1a组（43％vs20％,P＜0．05）;在有移植史组高于无移植史组（91％vs32％,P＜0．001）;在有妊娠组高于无妊娠组（40％vs8％,确切概率法P＝0．021）。结论：输血、移植、长期透析、妊娠是肾移植受致敏的重要因素。     

MACS系统对小鼠造血干细胞定向分化为未成熟树突状细胞的实验研究

目的:探讨经MACS系统在体外获得大量高纯度未成熟树突状细胞(imDC)的方法,并对其细胞表面标志、形态和功能进行鉴定。方法:对健康C57小鼠的骨髓通过MACS系统分离、纯化CD117 造血干细胞(HSC);使用SCF IL-3行体外扩增,并采用GM-CSF IL-4 IL-10诱导其定向分化为imDC;进而在倒置显微镜、扫描电镜以及透射电镜下观察其形态、功能,采用流式细胞计数法检测、鉴定其表面标志物的表达。结果:SCF IL-3可以分别在3、5、7d时体外扩增HSC达10.34±1.43倍、22.65±2.71倍、54.39±3.08倍;小鼠HSC可被成功诱导分化为imDC,且具有吞噬功能,表面树突呈毛刺状、较为短小,imDC并表达CD11c 、I-A/I-Elow、CD40-、CD80-、CD86-。结论:本方法可稳定、有效地获得大量高纯度的imDC。     

成人睾丸支持细胞的分离培养及其免疫豁免机制

目的：建立成人睾丸支持细胞的体外培养方法并探讨其免疫豁免机制。方法：依次用胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶及脱氧核糖核酸酶消化制备成人睾丸支持细胞，以SABC染色法检测支持细胞上Fas-L和TGF-β1的表达。将其与成人脾细胞共同培养，用MTT比色法检测其对脾细胞增殖的抑制作用。结果：成人睾丸支持细胞占培养细胞总数的80％以上，活性可达90％。睾丸支持细胞上可表达Fas-L和TGF-β1，体外可抑制共培养的脾细胞增殖。结论：建立了培养成人睾丸支持细胞的方法，其免疫豁免机制可能与Fas-L和TGF-β1的表达有关。     

银杏叶提取物对大鼠胰岛细胞获取和冻存的影响

背景:能否获取到足够的具有生物活性的胰岛细胞是影响胰岛细胞移植成功与否的主要原因之一,细胞冻存是收集足够胰岛的可行于段,但冻存复苏过程可引起细胞的凋亡.目的:观察银杏叶提取物对大鼠胰岛获取及冻存后功能的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-10/12在西安交通大学医学院环境与疾病相关基因教育部重点实验室完成.材料:选用成年SD大鼠40只用于分离提取胰岛细胞.方法:按随机数字表法将40只大鼠分为2组(n=20),银杏叶提取物组取胰腺前经尾静脉注射银杏叶提取物25 mg/kg,获取胰岛后冻存.复苏后分别在含银杏叶提取物的培养基中培养3,7,14,21 d(n=5).对照组尾静脉注射等量盐水,冻存、培养时间同银杏叶提取物组.主要观察指标:电镜下观察胰岛细胞形态:应用原位末端标记法检测细胞凋亡情况:以免疫组化法检测Bcl-2表达.结果:①银杏叶提取物组胰岛细胞复苏损失率明显低于对照组(P＜0.05).②与对照组相比,银杏叶提取物组胰岛细胞复苏培养3 d时内分泌颗粒及酶原颗粒增多明显.③银杏叶提取物组复苏培养21 d后胰岛细胞仍可保持45%左右的存活率,对照组胰岛细胞存活率＜35%,两组比较差异具有显著性意义(P＜0.05).④复苏培养7,14d,银杏叶提取物组胰岛细胞凋亡率低于对照组(P＜0.05),Bcl-2表达高于对照组(P＜0.05).结论:银杏叶提取物能够减少胰岛冻存复苏的损失,阻止胰岛细胞的凋亡,从而保护了胰岛细胞的活性.     

肾移植术后Tru-cut针活检、多谱勒超声检查和同位素肾血流动态观察的应用价值

目的　评估Tru-cut针活检、多谱勒超声检查（CDFI）、同位素肾血流动态观察（SPECT）在肾移植术后的应用价值。方法　随机选择30例肾移植患者,将单纯Tru-cut针活检、CDFI以及SPECT检测所得结论作对比。结果　三种方式诊断准确率依次分别是82%、73%、79%。结论　Tru-cut针活检、CDFI和SPECT检查,均可作为肾移植术后的常规检测手段,三种方法联合使用,在临床上有较高的应用价值。     

尸体肾移植术后加速性排斥反应的临床治疗体会

自1996年5月至1999年5月所行的300例尸体肾移植患者中,7例发生加速性排斥反应,发生率2．33％,经强有力的抗排斥治疗后6例完全逆转,排斥逆转率85．5％,目前这6例均健康存活,带肾存活率最长已达3年半;1例治疗无效切除移植肾。本文总结了加速性排斥反应的防台重点在于：早期诊断、及时强有力的抗排斥治疗以及有针对性的防治抗排斥治疗过程中可能出现的各种并发症。     

肾移植受者免疫风险分层评估标准的临床研究

目的分析尸体供肾移植受者术后发生急性排斥反应(acute rejection, AR)的术前危险因素并建立AR风险分层标准。方法回顾性分析2015年1月至2020年12月在西安交通大学第一附属医院接受尸体供肾移植且随访时间大于1年的1 382例受者资料, 根据受者术后1年内是否发生急性排斥反应, 分为急性排斥反应组(AR组, 115例)与非急性排斥反应组(非AR组, 1 267例)。对两组受者的临床资料进行单因素和多因素分析确定AR的危险因素并根据回归系数建立评分标准。根据受者评分结果将其分为低危组(907例)、中危组(450例)及高危组(25例), 并分析比较不同评分组受者AR发生情况。结果 1 382例受者中术后1年内发生急性排斥反应的115例, 总体AR发生率为8.32%(115/1 382)。单因素分析结果表明, 供者年龄、供受者年龄差≥25岁、受者群体反应性抗体(panel reactive antibody, PRA)+供者特异性抗体(donor specific antibody, DSA)阳性、供肾冷缺血时间≥12 h、供受者HLA错配数≥3、扩大标准供者(expand...