雷帕霉素发酵生物活性的测定方法

由吸水链霉功（Ｓｒｔ．ｈｙｇｒａｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＷＹ９３－Ｚ２７中分离出具有抗真菌和免疫抑制活性的雷帕霉素,主要存在于菌丝内,少量分泌到细胞外,为适应磊量菌种选育工作的需要,我们研究了：（１）几咱处理菌丝的方法,结果以ＳＤＳ裂解菌丝操作简便,省时,成本低;（２）固体发酵与液体发酵法生物生结果没有正相关关系。（３）一定条件下,发酵上清液效价可替代菌体效价用于初筛工作。     

响应面法优化必特螺旋霉素发酵培养基

目的利用响应面法对新一代必特螺旋霉素基因工程菌(Streptomyces spiramyceticus,WSJ-2),即含有整合型双拷贝4″位异戊酰基转移酶基因(4″-isovaleryltrasferase gene,ist)工程菌发酵培养基进行优化。方法以发酵效价和异戊酰螺旋霉素组分含量为指标,通过部分因子析因设计实验,筛选出影响较大的主要影响因子。其次,进行最陡爬坡实验,最后,通过中心组合设计,利用DX7trail 7.0软件进行回归分析,确定主要影响因子的最佳浓度,得到优化发酵培养基。结果综合培养基组成对发酵效价和组分含量的影响获得2个主要影响因子,即KH2PO4和NaCl,通过最陡爬坡实验和响应面法,确定了优化发酵培养基组成为(g.L-1):淀粉60、碳酸钙7.0、MgSO42.0、NH4NO36.0、酵母粉3.0、鱼粉15、MnCl20.10、NaCl 12.5、KH2PO40.645。验证实验表明在优化培养基中发酵相对效价为142%与预测值139%比较接近,效价比原配方提高了42%,而其总异戊酰基螺旋霉素组分的含量与原配方基本一致。结论对新构建的必特螺旋霉素基因工程菌采用响应面中心组合设计,可以较有效地进行发酵培养基的优化。     

利用强启动子PermE*提高4"-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平

目的 提高螺旋霉素生物转化为4"-异戊酰螺旋霉素的水平,为构建以4"-异戊酰螺旋霉素为主要组分的必特螺旋霉素新一代基因工程菌提供指导.方法 构建重组质粒pKC1139-e-ist-ist和pKC1139-ist-ist,它们分别含有5'-上游插入红霉素抗性基因强启动子PermE*的4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝,和4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝;将它们分别导入到变铅青链霉菌TK24中,比较它们对螺旋霉素的4"-异戊酰化能力.结果 在加入终浓度为50μg/mL螺旋霉素时,变铅青链霉菌TK24[pKC1139-e-ist-ist]比变铅青链霉菌TK24[pKC1139-ist-ist]对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平提高近4倍.结论 在变铅青链霉菌TK24中,PermE*可以增强4"-异戊酰基转移酶基因表达,明显提高对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平.     

利用胞膜高渗透性的大肠杆菌变株19-8来寻找新的抗菌素

抗代谢抗菌素的抑菌作用,仅在合成培养基上显出,因此只能利用在合成培养基上生长的大肠杆菌、枯草杆菌及其他菌属作为测定菌。一般的大肠杆菌菌株对许多抗菌素都有耐药性,这种耐药性通常是与大多数抗菌素不能透过大肠杆菌的胞膜有关。据报导,一些细胞膜有所改变的大肠杆菌变株,由于细胞的渗透性较好,对各种不同作用机理的抗菌素敏感性也就提高。因而作者认为,研究能在合成培养基上生长的大肠杆菌变株,把它作为寻找抗代谢抗菌素的测定菌是很有意义的。     

链霉菌产生的新型纤溶酶的纤溶性质和溶栓作用

目的旨在进一步确证纤溶活性的蛋白酶SW-1的溶栓作用和性质。用体外加热平板法、试管凝块法和在体内对大鼠静脉血栓溶解及对纤溶因子的作用等实验,发现SW-1在体外可直接降解纤维蛋白,而无激活纤溶酶原的作用。在体内,SW-1对大鼠静脉血栓有显著的溶解效果,与同剂量尿激酶的溶栓作用相当。给药(iv)30min后,SW-1引起大鼠血浆中纤溶酶、纤溶酶原水平提高,纤维蛋白原水平下降,而对组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、α₂-纤溶酶抑制剂无显著影响。提示SW-1是一种具有纤溶活性的蛋白酶,而不是纤溶原激活剂。     

肌原纤维调节因子-1在心肌肥大中的作用研究

目的：研究肌原纤维调节因子-1(MR1)在心肌肥大中的变化及其作用。 方法： 选取rMR1 mRNA的3个Stem-loop结构作为靶点，构建RNA干扰载体，对乳鼠心肌细胞进行瞬时转染，通过定量RT-PCR，选定第1靶点进行RNA干扰以封闭MR1基因；采用心肌细胞［3H］-亮氨酸掺入、形态学检测、蛋白质提取、Western blotting技术，检测蛋白合成速率、细胞表面积、rMR1蛋白表达等指标，观察MR1基因沉默对于血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, AngⅡ)诱导的乳鼠心肌细胞肥大的影响。 结果： AngⅡ组［3H］-亮氨酸掺入较对照组增加24.1%(P<0.01)，其细胞表面积较对照组高65.8%(P<0.01)，rMR-1蛋白表达水平升高；AngⅡ的上述作用可被卡托普利完全消除；MR1基因封闭后，由AngⅡ诱导的［3H］-亮氨酸掺入降低30.2%(P<0.01)，细胞表面积较AngⅡ组降低31.1%(P<0.01)，rMR-1蛋白表达较对照组减少。 结论： AngⅡ诱导的心肌细胞肥大与rMR-1表达上调有关。MR-1可能通过促进心肌收缩蛋白的合成参与心肌肥大的发生。     

阿奇霉素静滴治疗支原体肺炎45例临床分析

我科从2002年3月-2004年3月采用国产阿奇霉素静滴治疗小儿支原体肺炎45例，观察其临床疗效及安全性，现总结如下。     

Geldanamycin产生菌生物合成相关基因的克隆与分析

目的：从geldanamycin产生菌吸水链霉菌（S.hygroscopicus)中克隆生物合成基因，为阐明生物合成机制及改造其结构奠定基础。方法：以链霉菌／大肠埃希氏菌穿梭cosmids pKC505为载体构建了插入片段为20－30kb的S.hygroscopicus总DNA文库，以利福霉素中与3－氨基－5－羟基苯甲酸（AHBA）合成相关基因为探针，经菌落杂交，Southern杂交筛选同源基因片段，测序结果与Genbank进行同源性比较分析，并以attp-噬菌体载体KC515利用基因阻断实验对克隆的基因片段进行功能鉴定。结果：构建的基因文库含重组基因比率高，基因组覆盖率高，稳定性好，经同源基因探针杂交，从文库中筛选出9个阳性cosmids克隆pCGB20,pCGB26,pCGB28,pCGB29,pCGB36,pCGB45,pCGB49,pCGB63,pCGB75，测序分析表明，cosmid pCGB20中BamHI-BamHI 8kb片段两端的不完整ORF编码蛋白与竹桃霉素（oleandomycin)PKS Module 5,Module 6(一致性为79％）和红霉内酯合成酶ORF2（一致性为75％），ORF1（一致性为73％），ORF3（一致性为70％），高度同源；BamHI-BamHI 3kb片段一端与编码类结核分枝杆菌的磷酸吡哆醛依赖的氨基转移酶家族中半胱氨酸脱硫酶的DNA有同源性，该家族与AHBA合成酶关系密切，Cosmid pCGB20的BamHIBamHI 8kb及BamHI-BamHI 3kb基因片段已通过基因阻断实验初步鉴定，证明它们参与geldanamycin生物合成，而其他cosmids阳性克隆的序列分析及功能研究尚在进行中。     

国外耐药菌情况及战胜耐药菌的途径

由于细菌对抗生素的耐药性使感染性疾病对人类健康造成的危害日益增长。万古霉素是唯一治疗多重耐药性金黄葡萄球菌的抗生素，耐对万古霉素耐药的肠球菌在美国１９９３年比１９８９年增长了２０倍。细菌对抗生素的耐药也使如淋病、痢疾的结核病等再起，后者被认为是世界最大的细菌杀手。据世界卫生组织统计，世界有１／３人口携带结核分枝杆菌，５０００万人携带耐药菌。对人的生命造成威胁的至少有３种细菌：粪肠球菌（Ｅｎｔｅｒｏ     

检测铜绿假单胞菌临床分离株外膜通透性的方法

建立了一种简易可行的测定铜绿假单胞菌对药物外膜通透性的方法，在此基础上，对临床分离的耐β－内酰胺类抗生素（至少耐１种β－内酰胺类抗生素）的铜绿假单胞菌测定了对头孢唑林及亚胺培南／西司他丁的外膜通透性，结果表明：在测试的１０１株菌株中对头孢唑林的通透率为１００％的有７株，占６．９３％；而在测试的３２株菌株中对亚胺培南／西司他丁的通透率为１００％的有７株，占２１．８７％，１０株对头孢唑林敏感的大肠杆菌均显示良好的外膜通透性。并对建立的方法进行了讨论。