重组沙门菌表达结核分枝杆菌ESAT-6及其特异性免疫应答分析

Objective To determine the immune responses induced by recombinant Salmonella ty-phimurium expressing the secreting antigen ESAT-6 of Mycobacterium tuberculosis. Methods ESAT-6 cod-ing gene was cloned and identified by PCR and sequencing. Prokaryotic expression plasmid pYA33-esat car-rying the ESAT-6 coding sequence was constructed firstly and electro-transformed into an attenuated strain X4550 of Salmonella typhimurium, the recombinant bacteria was named as X4550(33-esat). C57BL/6 mice were immunized intranasally (I. N) with 108 CFU recombinant bacteria at day 0 and 18. Cells from spleen, lung, mesenteric lymph node (MLN) and Peyer's patch (PP) were collected from mice after second immu-nization, and the specific IFN-γ-secreting cells and IL-4-secreting cells were detected by ELISPOT assay u-sing ESAT-6 peptide as stimulus. Furthermore, CTL effects were in vivo evaluated by CFSE assay. Results The results showed that cellular immune responses specific for ESAT-6 could be detected by ELISPOT assay. In lung and PP cells, immune responses against ESAT-6 were biased toward Th1 type, the frequency of IFN-γ-secreting cells was much higher than that of IL-4-secreting cells. In splenocytes and MLN cells, the anti-gen specific immune responses acted as Thl and Th2 balance, the frequency of IFN-γ-secreting cells was close to that of IL-4-secreting cells. CFSE assay indicated that recombinant bacteria could induce the high level of CTL effects specific for ESAT-6 peptide. Conclusion These results suggested that recombinant Sal-monella typhimurium X4550(33-esat) not only can induce cellular immune responses, but also can elicit specific CTL responses after I. N immunization. It also provided the useful information for the control of infec-tious disease of tuberculosis.     

鸡IL-2、IL-1 8、IFN-γ cDNA和CpG DNA在减毒沙门菌运送H5亚型禽流感DNA疫苗中的佐剂作用

目的 探讨鸡IL-2、IL-18、IFN-γ cDNA和CpG DNA在减毒沙门菌运送H5亚型禽流感DNA疫苗中的佐剂作用。方法 将携带禽流感病毒（AIV）DNA疫苗的重组沙门菌SL7207（pVAX1-HA-IL2）、SL7207（pVAX1-HA—IL18）、SL7207（pVAXt—HA—IFN-γ）、SL7207（pVAX1—HA—CpG）、SL7207（pVAX1-HA）和SL7207（pVAX1）经口服和滴鼻途径首免1日龄商品代伊莎褐蛋鸡，测定免疫鸡的体液和黏膜免疫应答水平，并进行攻毒保护试验。结果 二免后3周，SL7207（pVAX1-HA—CpG）、SL7207（pVAX1-HA-IFN-γ）免疫组以及SL7207（pVAX1-HA）和SL7207（pVAX1-IFN-7）联合免疫组鸡产生了较高水平的特异性黏膜免疫应答（P〈0．05），但重组菌免疫鸡血清中抗AIV HI抗体水平与空载体组相比差异无统计学意义。SL7207（pVAX1-HA-CpG）、SL7207（pVAX1-HA—IFN-7）的免疫保护指数显著高于阴性对照组。结论 初步观察佐剂效应依次为：CpG〉IFN-7〉IL-18，IL-2未表现出佐剂效应。     

肠炎沙门菌ΔspiCΔcrp基因工程疫苗候选株的构建

目的 构建肠炎沙门菌ΔspiCΔcrp双基因缺失株,以探索其作为新型基因工程疫苗的可能性。方法 以等位基因同源重组方法,在构建单基因缺失肠炎沙门菌ΔspiC基础上,运用λRed重组酶系统构建双基因缺失株肠炎沙门菌ΔspiCΔcrp。结果 PCR和抗生素抗性结果表明肠炎沙门菌ΔspiCΔcrp成功构建;生物学鉴定显示,与野生菌相比,其生长速度与生化特性发生了变化,LD₅₀提高约1 000倍,毒力显著降低。结论 双基因缺失株肠炎沙门菌ΔspiCΔcrp被成功构建,为其作为疫苗的免疫学评价奠定基础。     

嵌合鞭毛蛋白fliC/esat佐剂效应的研究

目的:研究嵌合形式表达的鞭毛蛋白对结核分枝杆菌(MTB)抗原ESAT-6的免疫佐剂效应。方法:用PCR方法扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白基因fliCi及MTB抗原ESAT-6编码序列,通过重叠PCR将ESAT-6编码序列插入fliCi的高变区域,构建嵌合鞭毛基因片段fliC/esa。t将fliC/esat片段分别插入原核表达载体pET,构建pET-fliC/esat质粒。将ESAT-6编码序列插入原核表达载体pBCX的多克隆位点,构建原核表达质粒pBCX-esat。以质粒pET-fliC/esat及pBCX-esat分别转化大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基1-1硫代-β呋喃半乳糖苷诱导融合的嵌合蛋白fliC/esat及ESAT-6蛋白的表达。以抗ESAT-6 mAb HYB 076-08为一抗,通过W estern b lot鉴定嵌合蛋白fliC/esat及ESAT-6蛋白。以两种蛋白分别在体外刺激骨髓树突状细胞(BMDCs),通过FACS分析共刺激分子CD40、CD80、CD86和CD54的表达,同时用ELISA检测前炎性因子IL-12p70表达的水平。此外,以两种蛋白分别免疫C57BL/6小鼠,运用ELIS...     

单核细胞增生性李斯特菌作为肿瘤疫苗运送载体的研究进展

单核细胞增生性李斯特菌是一种兼性胞内寄生菌,能直接感染抗原递呈细胞,使所运送的外源抗原可以同时进入MHCⅠ类和MHCⅡ类抗原递呈途径,从而诱导强烈的CD⁺₈T细胞和CD⁺₄T细胞免疫应答。目前,减毒李斯特菌作为一种新型的活疫苗载体,在运送宫颈癌、黑色素瘤等肿瘤相关抗原方面业已取得较好的免疫保护效果,在抗肿瘤治疗中显示出诱人的前景。本文综述了单核细胞增生性李斯特菌的免疫应答特性及其作为治疗性肿瘤疫苗载体的相关研究进展。     

全基因组测序在细菌耐药性分析中的应用

细菌耐药性特别是多重耐药性已经成为全球共同关注的问题,其严重威胁疾病的治疗,并造成巨大的经济损失。传统的耐药性分析方法耗时耗力,全基因组测序作为一种新型技术,可能会成为一种简单、快速和高效的耐药性分析方法,且具有较好的敏感性和特异性。除了在已知耐药基因型确定和耐药表型预测外,该方法还可发现新的潜在的耐药基因。现对全基因组测序在细菌耐药性中的应用作一综述。     

沙门菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR检测方法的建立及应用

目的建立沙门菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR检测方法,提高检测效率和敏感性。方法选择沙门菌组氨酸转运操纵子基因、产单核细胞李斯特菌溶血素基因序列设计引物,在单一PCR方法基础上,建立检测两种病原菌的多重PCR技术。结果在495bp和850bp处分别出现预期的特异性DNA扩增条带,敏感性试验显示该体系能检测出32pg的沙门菌DNA和274pg的李斯特菌DNA,样品检测表明该方法与单一PCR和国标方法的符合率达100%。结论本研究建立了能同时检测沙门菌和产单核细胞李斯特菌的多重PCR技术,为主要食源性病原菌快速检测提供了新方法。     

红细胞富集与多重RT-PCR联合检测禽流感病毒

目的对禽流感病毒H5、H7亚型进行更快速、更灵敏检测。方法根据禽流感病毒(AIV)核蛋白基因和血凝素基因设计3对特异性引物,建立在结合红细胞富集AIV病毒的基础上进行多重RT-PCR检测方法。结果该方法在1个反应体系中不仅能够鉴定A型流感病毒,而且可以同时确定是否为H5和H7亚型AIV;该方法的检测下限可达2.5pg的病毒RNA;对于参考毒株都可以扩增出预期大小的基因片段,而对新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的平行对照结果均呈阴性。结合AIV能够吸附鸡红细胞并在一定条件下解离的特点,利用鸡红细胞对48份已确诊样品进行病毒富集,然后用建立的多重RT-PCR方法检测富集产物结果显示48个样品中,30个为H5亚型AIV阳性,与病毒分离结果完全一致。结论由以上结果初步表明本研究建立的检测方法快速,特异,在禽流感临床筛检中显示出良好的应用前景。     

斑点免疫金渗滤法快速检测沙门氏菌O_9抗原的研究

目的　利用针对沙门氏菌O9抗原单克隆抗体 3- 4 7- 0和胶体金标记亲和纯化的羊抗鼠IgG ,建立一种以微孔滤膜为固相载体 ,快速检测沙门氏菌O9抗原的斑点免疫金渗滤法 (DIGFA)。方法与结果　以沙门氏菌点膜 ,加入单抗 3- 4 7- 0 ,洗涤后再加入胶体金标记的羊抗鼠IgG ,阳性结果呈红色圆点 ,阴性结果无颜色 ,整个检测过程仅需 10min。肠炎沙门氏菌标准菌株测定该方法灵敏度为 6× 10 4CFU/点。该方法可检测所有已知含O9抗原的沙门氏菌 ,而不与其它沙门氏菌、肠杆菌科其他细菌和常见革兰氏阳性细菌反应。人工感染样品经前增菌和选择性增菌处理后即可进行瞬时检测。结论　建立了一种快速、简便、准确检测沙门氏菌O9抗原的斑点免疫金渗滤法 ,在人类医学和动物医学领域有着广阔的应用前景     

牛结核病诊断技术的研究进展

结核病是人类已知的最古老的疾病之一 ,一直严重威胁着人类和动物的健康 ,造成了巨大的经济损失。由于卡介苗(BCG)的使用 ,结核病的发病率比过去有所下降 ,但是近年来由于艾滋病、器官移植等导致的免疫抑制 ,耐药菌株的出现 ,以及吸毒、酗酒、贫困、国际旅游、难民迁移等多种原因 ,该病的发病率又渐呈上升趋势。牛结核病被国际兽疫局(OIE)列为B类动物疫病 ,是一种人兽共患传染病 ,可以通过吸入含菌气溶胶或食用受污染的乳制品而从牛传染到人〔1〕,其传播和流行影响着畜牧业的持续发展和人类的健康。在西方一些畜牧业发达的国家 ,牛群的结…