重组人可溶性TRAIL分子诱导细胞凋亡机理探讨

目的探讨重组人可溶性TRAIL蛋白(rhsTRAIL)诱导细胞凋亡的机理.方法应用DNA染料和流式细胞仪定性分别检测rhsTRAIL诱导的细胞凋亡;流式细胞仪检测靶细胞膜表面TRAIL受体表达格局,荧光定量法检测凋亡细胞中Caspase-3活性.结果100ng/ml人可溶性TRAIL蛋白分子对外周血淋巴细胞无明显毒性,但可诱导肿瘤细胞凋亡,不同的肿瘤细胞凋亡率有差异,凋亡范围在26%～57%.不同细胞表面TRAIL受体表达量不同,外周血淋巴细胞的死亡受体DR4、DR5受体表达5%,而诱骗受体DcRl表达55%,相反肿瘤细胞上的DR4、DR5表达高(40%～88%),而DcRl表达很低(8%～17%).rhsTRAIL诱导HL-60细胞发生凋亡,其细胞内Caspase-3活性增高.ActD可增加TRAIL抑制细胞生长活性.结论重组人可溶性TRAIL蛋白分子可诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡活性TRAIL受体类型及Caspase-3活性增高有关.     

丹参对衰老鼠脑海马神经细胞凋亡作用的研究

目的：研究丹参对衰老鼠脑海马神经细胞凋亡的作用。方法：用TUNEL法及流式细胞仪观察衰老鼠的神经细胞凋亡,并用免疫组织化学法检测相关基因表达变化。以丹参注射液干预衰老的大鼠模型,观察了丹参对衰老鼠神经细胞凋亡的作用。结果：衰老鼠海马细胞有典型的凋亡特征,与丹参组比较海马细胞的凋亡率有明显差异,衰老鼠bcl-2表达下调,bax的表达量明显增加,基因表达变化与流式细胞仪测定的细胞凋亡率一致。结论：丹参对衰老鼠的脑神经细胞凋有明显的抑制作用。     

低分子量肝素干扰免疫细胞黏附类风湿性关节炎滑膜细胞的体外研究

目的:研究低分子量肝素(LMWH)对免疫细胞黏附类风湿性关节炎(RA)滑膜细胞(FLS)的影响和初步机制,探讨LMWH在RA抗炎应用中的可行性。方法:用流式细胞仪定量计数法研究LMWH在体外干扰健康人外周血单核细胞(PBMC)黏附RAFLS的作用。用实时定量聚合酶链式反应(PCR)检测体外培养的RAFLS中血管诱导生成因子61(CYR61)表达格局。结果:在FLS培养系统中加入PBMC时,PBMC明显黏附于FLS。当加入LMWH时,PBMC对于FLS的黏附减少,表现为脱落PBMC数量增加。随着加入LMWH剂量增加,脱落PBMC数量相应增加。结论:RA患者滑膜组织高表达CYR61分子。LMWH能抑制RAFLS和PBMC的黏附,且呈剂量依赖性。LMWH干扰PBMC黏附FLS的作用与竞争结合了CYR61上的硫酸肝素位点有关。     

单用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白及联合甲氨蝶呤对胶原诱导性关节炎大鼠关节骨破坏影响的实验研究

目的 通过建立胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型,评价单用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR:Fc)及其联合甲氨蝶呤在抑制CIA大鼠关节骨破坏方面的作用及机制.方法 利用皮下注射牛Ⅱ型胶原诱导Wistar大鼠发病,建立CIA大鼠模型.将造模成功,炎症评分≥2分的CIA大鼠随机分为生理盐水组(0.4 ml/周,腹腔注射)、甲氨蝶呤治疗组(1 mg周,腹腔注射)、rhTN FR:Fc治疗组(0.8 mg,每周2次,腹腔注射)、甲氨蝶呤+rhTN FR:Fc治疗组(甲氨蝶呤1 mg/周+rhTNFR:Fc 0.8mg,每周2次,腹腔注射).治疗8周后,处死大鼠,取踝关节拍摄X线片,胫骨上段行微计算机断层扫描技术扫描和制作硬组织切片,观察各组踝关节骨破坏情况,评价胫骨上段骨小梁变化及骨量变化.统计学处理采用SNK-q检验.结果 治疗8周后,rhTN FR:Fc组,甲氨蝶呤+rhTNFR:Fc组骨小梁面积百分数[(29.1±0.3)％,(26.7±0.6)％]及骨小梁数量(4.4±0.5)/mm,( 4.0±0.6 )/mm]明显高于0.9％氯化钠注射液组和甲氨蝶呤组[(12.9±0.5)％,( 13.2±0.4)％与(2.0±0.3 )/mm,(2.2±0.2)/mm](P＜0.01);rhTNFR:Fc组、甲氨蝶呤+rhTNFR:Fc组骨小梁分离度明显小于0.9％氯化钠注射液组和甲氨蝶呤组(P＜0.01).结论 单用rhTNFR:Fc及联合甲氨蝶呤均具有明显抑制关节骨破坏的作用,且其抑制炎症关节周围骨量减少的作用与抑制局部骨小梁数量减少及骨小梁分离度的增大相关.     

混合表皮淋巴细胞培养体系中IL—10表达在诱导免疫抑制中的作用

在前期对混合皮肤移植诱导局部耐受的免疫学机理研究中，我们发现将自体角朊细胞引入已建立的MELC体系可以诱导免疫抑制。平行工作也证实自体角朊细胞的引入可以使体系内的细胞因子格局发生从Th1向Th2的转变。我们用针对IL－10的单抗对自体角朊细胞在MELC体系中所诱导的免疫抑制进行封闭，以证实IL－10在角朊细胞所诱导的免疫抑制中的作用。进而我们将混合培养体系中的各细胞组份分离，证实在MELC体系中IL－10 mRNA主要来源于自体角朊细胞。     

识别猪SLA的特异性人T细胞系TCR BV基因取用格局和CDR3结构多样性分析

不同T细胞克隆TCR分子的序列不同 ,所识别的抗原特异性也不同。其中第三互补决定区 (CDR3)变异最大 ,是TCR主要的抗原结合部位。本文采用荧光标记半定量PCR技术 ,用DNA测序仪作程序分析 ,了解猪细胞抗原致敏前后的人T细胞群和 5个T细胞系 2 4个TCRBV基因家族取用格局 ,并以TCRα链C区的基因片断作为内参对取用情况作定量估计。发现首次抗原致敏后培养 2周的T细胞除了BV2 4、BV8和BV10未能检测出 ,其它BV基因都有不同程度的取用。然而 ,5个细胞系的TCRBV基因呈现十分有限的取用格局 ,其中两个CD4+ T细胞系都取用BV12和BV14;3个CD8+ T细胞系中都优势取用BV1,有两个还取用BV19。CD4+ T细胞系和CD8+ T细胞系之间TCRBV无交叉取用 ,提示两类细胞识别的抗原表位存在差异。进一步用变性凝胶扫描分析上述T细胞系取用TCRBV中的CDR3的多样性 ,发现未经抗原致敏的T细胞BV的CDR3结构为多峰型且呈正态分布 ,表明涉及多种结构不同的细胞克隆 ;而抗原特异性T细胞系CDR3除了一个CD8+ T细胞系BV1有两个主峰外其它无例外地都显示单峰或者仅一个主峰 ,这从另一个角度证明建系T细胞的单克隆性。     

自体角朊细胞引起Th1向Th2极化抑制同种异体免疫应答

我们已有的工作揭示 ,在混合皮肤移植的体外模型MELC中 ,自体角朊细胞可通过间接递呈同种异体抗原诱导免疫抑制。本文在此基础上 ,进一步分析其中Th1和Th2相关细胞因子含量的变化。结果发现 :(1)向MELC引入自体角朊细胞后约 32h ,原同种异体应答中出现的IFN γ和IL 2分泌格局开始让位于IL 4和IL 10 ,6 4h后IFN γ和IL 2完全消失 ,表明发生了淋巴细胞Th1向Th2亚群的极化 ;(2 )单抗封闭试验表明 ,IL 10在其中起关键作用 ;(3)经自体和异体角朊细胞调变过的淋巴细胞对MELR的作用相反 ,前者抑制 ,后者促进。这是首次从T亚群相互作用上探索并揭示混合皮肤移植引起局部免疫耐受的机制。     

人T细胞对猪白细胞抗原的直接识别

猪已被认为是异种移植的最理想供体。有关人 猪器官间超急性排斥研究已有所突破 ,而细胞性排斥报道尚少。本文用混合淋巴细胞反应体系研究异种移植细胞性排斥机制 ,发现异种反应明显弱于同种反应 ,而且以直接识别为主 ,这和同种移植细胞性排斥机制一致。抗人CD4单抗和抗猪白细胞抗原SLA DR、DQ单抗都能明显地抑制 (XMLR) ,而抗人CD8单抗无抑制功能 ,表明CD4+T细胞对SLA的识别在异种排斥应答中起重要作用     

GADD45β参与类风湿关节炎发病机制研究(2)—GADD45β介导类风关CD4~+T细胞抗凋亡研究

在发现了GADD45β在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)病灶局部组织细胞中、CD4+T细胞表达增高并参与介导IFN-γ产生的基础上,进一步探讨GADD45β参与RA的其他机制。用siRNA干扰人PBMC中GADD45β基因表达。Real-time PCR检测GADD45β和凋亡相关基因的表达格局。用RA患者滑膜液(RA synovial fluid,RA SF)刺激GADD45β基因敲除的健康人PBMC并用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果RA患者的SFMC中T细胞凋亡减少。用SF刺激正常人PBMC时细胞凋亡减少。经siRNA干扰后PBMC中GADD45β的表达明显降低,同时细胞凋亡增加。同时检测与凋亡相关基因发现SF刺激后Bcl-2分子在凋亡的细胞中表达明显降低,而Fas-FasL、Bcl-2家族其他分子如Bcl-xl、Bax、Bim等变化不明显。GADD45β参与介导RA的炎症性T细胞凋亡,而Bcl-2分子参与了由GADD45β介导抗凋亡作用,而这一作用与RA患者滑膜液中炎症细胞能够长期存活并介导炎症可能有密切关系。     

类风湿关节炎患者T细胞抗原受体BV基因的限制性取用初步研究

目的 研究类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者病灶部位即关节滑膜组织浸润的受某种自身抗原驱动的T淋巴细胞抗原受体（T cell receptor，TCP）β链的取用格局。方法 采用实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的方法分析RA患者病灶部位T淋巴细胞抗原受体β链的取用：采用PCR—SSP方法对所调查的RA患者的人类自细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）进行了分型。结果 研究发现中国人群RA患者病灶关节滑膜浸润的T淋巴细胞抗原受体主要取用BV14和BV16家族：中国人群RA患者HLA基因型主要以HLA DRBI＊0405为主要特征，与白种人RA患者不同。结论 研究提示中国人群RA患者病灶区自身反应性T细胞具有TCR BV14和BV16的限制性取用．其中TCR BV16的偏移为国内外首次报道。而HLADRBI＊0405类风湿关节炎患者表现出TCR BV16取用的趋势，提示TCR BV16取用受主要组织相容性复合体（MHC）的约束，这为进一步分析诱发RA的发生的免疫异常和自身反应性T细胞的生物学特陛提供了重要试验基础。