IFN-γ经共抑制分子B7-H1正向调控小鼠骨髓间充质干细胞免疫抑制的研究

目的 探讨IFN-γ通过137-H1/PD-1通路正向调节骨髓问充质干细胞(MSC)免疫抑 制作用机制,为MSC用于治疗免疫性疾病提供新的理论依据.方法 首先体外获得纯化鼠源MSC 并进行三向分化鉴定;间充质干细胞和淋巴细胞反应体系进行共培养,3H掺入试验测定细胞增殖水 平;ELISA检测共培养上清中IFN-γ、TGF-β、TNF-α、IL-10因子的表达水平;流式检测共培养中MSC B7-H1分子的变化;siRNA干扰MSC B7-H1后,3H掺入试验测淋巴细胞增殖水平的改变,采用Tr-answell培养方法 确认MSC通过细胞间接触发挥作用.结果 体外鼠源MSC经过5代的反复贴壁纯化之后,形态均一纯度高,并具有向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞分化的能力;MSC与混合淋巴细胞反应、Con A刺激的淋巴细胞反应以及anti-CD3/CD28刺激活化的淋巴细胞反应混合共堵养,3H掺入试验结果 均显示增殖反应被抑制(P=0.0167,0.0081,<0.0001),其抑制作用呈现对MSC细胞的剂量依赖;共培养上清中细胞因子IFN-γTNF-α均显著升高,而TGF-β、IL-10未检测到,同时共培养中MSC表面B7-H1分子明显表达上调(P<0.05);经B7-H1特异siRNA干扰MSC后,共培养并检测淋巴细胞增殖反应,细胞增殖水平明显较干扰前提高(P<0.05),Transwell膜分隔后MSC抑制干细胞活化明显减弱(P<0.05).结论 MSC经共培养环境中IFN-γ刺激后,表面B7一H1分子的表达上调并通过B7-H1/PD-1通路抑制T细胞活化增殖.将来这种MSC可以用于治疗多种自身免疫性疾病.     

人FasL胞外区cDNA的克隆及表达

应用RT PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增FasL胞外区cDNA ,克隆入PCR2 1载体 ,测序验证后在大肠杆菌DH5α中表达 ,经亲和层析柱纯化 ,Westernblot鉴定所得表达产物为可溶性人FasL胞外区蛋白。     

灭活自体T细胞增强小鼠免疫功能作用机制的研究

接种灭活自身反应性T细胞用于治疗自身免疫性疾病已获初步成效。本研究采用辐射方法灭活ConA活化自体T细胞,经皮下和腹腔免疫正常的C57BL/6J小鼠,结果发现,该免疫方案可明显上调T细胞功能,表现为:免疫小鼠体内活化T细胞增多且Th1型细胞因子分泌增加,淋巴细胞体外增殖能力增强且凋亡细胞明显减少。进一步研究结果提示,接种灭活自体T细胞可能通过上调Fas、GADD45β及下调FasL基因表达而促进T细胞的活化和存活,并增加其生物学功能。这些结果表明,自体T细胞免疫具有增强机体的细胞免疫功能,为其抗肿瘤免疫作用提供了一定的实验依据。     

自体灭活T细胞免疫后诱导Treg下调的机制

目的 探讨自体灭活T细胞免疫注射后诱导体内调节性T细胞（Treg）下调的机制。方法 自体T细胞体外用刀豆蛋白(ConA)刺激活化,照射灭活T细胞给小鼠进行皮下和腹腔免疫（每只小鼠5×106/次）,每隔5 d免疫一次,免疫3次后检测小鼠体内Treg的数量及功能;对照组小鼠皮下注射PBS。ELISA法检测血清中抗鼠CD25抗体。免疫小鼠血清分离后经尾静脉注入未免疫小鼠体内,检测受体小鼠Treg的数量及功能变化。结果 免疫小鼠体内CD4+CD25+Foxp3+ Treg数量较对照组减少（P<0.01）,抑制功能也显著降低（P<0.01）,但血清中抗CD25的抗体增加（P<0.01）。正常小鼠接受免疫小鼠血清后,Treg的数量和抑制功能下调（P<0.01）。结论 采用ConA 活化的自体灭活T细胞免疫,可诱导抗CD25抗体增加,进而减少体内CD4+CD25+Foxp3+ Treg 细胞数量和功能。     

Cyr61促进RA滑膜细胞增殖及炎症因子调控研究

目的:采用类风湿性关节炎(RA)患者滑膜细胞的体外培养,研究基质蛋白Cyr61在RA滑膜细胞增殖中的作用及其机制。方法:通过Real-time PCR、Western blot和免疫组化检测RA病人的滑膜组织和细胞中Cyr61的表达情况;用3H-TdR掺入法检测滑膜液(SF)对滑膜细胞增殖的影响;用ELISA方法检测RA患者滑膜液中Cyr61蛋白的水平。结果:RA病人的滑膜组织和细胞中高表达Cyr61;SF能刺激滑膜细胞发生明显增殖;且RA患者滑膜液中含高浓度的Cyr61蛋白。用SiRNA干扰技术抑制滑膜细胞中Cyr61基因表达,再加入滑膜液后,则滑膜细胞增殖明显降低。同时,将SF与anti-Cyr61抗体共同孵育后再刺激滑膜细胞,FLS也不再发生明显增殖。进一步研究滑膜液中与上调Cyr61表达有关的炎症细胞因子,发现SF中IFNγ-和TNFα-具有上调Cyr61蛋白表达的作用。结论:Cyr61蛋白是促进滑膜细胞增殖的重要调控基因;RA患者滑膜液中含有高浓度的炎症因子IFNγ-和TNFα-,通过上调Cyr61蛋白表达而促进滑膜细胞增殖,可能是促进RA病理性滑膜增生的重要因素之一。     

青藤碱对类风湿关节炎患者滑膜细胞与炎性细胞黏附作用的研究

类风湿关节炎（RA）是一种以关节慢性滑膜炎症为特征的全身性自身免疫疾病。缓解疼痛,减轻关节病理损害,延缓关节畸形变是治疗的主要目标。青藤碱（sinomenine）是从中药青风藤中提取的生物碱单体,具有显著的镇痛和消炎作用,其盐酸盐制剂临床上用来治疗类风湿关节炎,并取得较好疗效。     

混合皮肤移植中自体角朊细胞转染B7-1后诱导抑制功能的改变

目的 分析混合皮肤移植中自体角朊细胞转染B7-1基因后功能的改变，并探讨传统共刺激分子和MHC Ⅱ类分子等在自体角朊细胞诱导的局部免疫耐受中的作用。方法 利用建立的MELC体外模拟系统，对自体角朊细胞进行B7-1基因的转染，观察转染前后自体角朊细胞诱导抑制能力的变化，同时通过抗CTLA-4单抗及HLA Ⅱ类分子的封闭实验，观察这些分子在自体皮岛抑制效应中的作用。结果 自体角朊细胞转染B7-1基因后，诱导局部免疫抑制的能力消失，如果加入抗B7-1单抗阻断B7-1的作用后，其诱导抑制的能力又恢复；抗CTLA-4单抗不能阻断自体角朊细胞在实验体系中的抑制作用；用单抗所作的封闭实验结果表明。抗HLA-DR单抗封闭组对自体角朊细胞对MELR抑制诱导的影响最小（P〉0．05），抗DQ单抗则可以对MELR的抑制得到最大幅度的回复，而抗DP单抗也可以使体系中cpm值有一定的回升。结论 混合皮肤移植中，自体角朊细胞之所以可以诱导局部免疫耐受，是通过B7-1以外的其他共刺激信号激活Th2亚群、进而遏制Th1亚群来诱发抑制的，而且这种抑制与CTLA-4的负向调节无关。并具MHC限制性。     

Cyr61、TNF-α、IL-6和IL-1β与颈动脉损伤后再狭窄的关系

目的 探讨富含半胱氨酸61蛋白(Cyr61)及组织炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β与颈动脉损伤后再狭窄发生的关系.方法 36只Wistar大鼠随机分为模型组和对照组(n=18).模型组大鼠经2F Fogarty球囊导管损伤左颈总动脉建立颈动脉血管成形术模型,分别于建模后1、4、7、14、28 d和3月取材,观察血管壁组织的病理学改变;免疫组化和Real-time PCR技术检测血管壁组织中Cyr61、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达变化;ELISA法测定血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平.结果 球囊损伤后血管壁新生内膜在术后7 d出现,术后28 d时达到高峰;形成的新生内膜厚度不均,较对照组明显增厚(P<0.01);大鼠颈总动脉损伤后,血管壁组织Cyr61、TNF-α、IL-6和IL-1β表达明显升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);而血清炎症因子水平无明显变化.结论 大鼠颈总动脉球囊损伤后血管壁Cyr61、TNF-α、IL-6和IL-1β表达明显增强,提示Cyt61可能与炎症因子相互协同作用,使血管壁组织增生而最终导致再狭窄的发生.     

B7-H1分子在混合皮肤移植中自体角朊细胞诱导的抑制作用

目的探讨B7-H1在混合皮肤移植中自体角朊细胞诱导的局部免疫耐受中的作用。方法在加入与不加入自体角朊细胞的实验系统中，利用混合表皮淋巴细胞培养（MELC）体外模拟系统，检测角朊细胞表达B7-H1的情况，并观察抗B7-H1和PD-1单抗对自体角朊细胞诱导的免疫抑制的影响情况。结果在引入自体角朊细胞的MELC体系中，刚分离的角朊细胞并不表达B7-H1，但在4h开始有微弱的表达，而〉8h就有较强的表达；而未引入自体角阮细胞的MELC体系中，则始终未检测到B7-H1的表达。而且自体角朊细胞对自体淋巴细胞对异体表皮细胞的同种异体增殖反应的抑制作用能被抗B7-H1和PD-1的单抗阻断。结论混合皮肤移植中，自体角朊细胞可能是通过B7-H1提供共刺激信号，激活Th2亚群，遏止Th1亚群，从而抑制后者介导的细胞免疫。     

氧化砷诱发胃癌细胞株凋亡的初步研究

目的在三氧化二砷（Ａｓ２Ｏ３）治疗ＡＰＬ的基础上，进一步探讨Ａｓ２Ｏ３能否诱发胃癌细胞株凋亡。方法采用荧光标记法，经流式细胞仪和荧光显微镜观察Ａｓ２Ｏ３对ＭＫＮ４５和ＳＧＣ７９０１胃癌细胞株的凋亡诱发率和形态学改变。结果发现Ａｓ２Ｏ３诱发胃癌细胞凋亡率高于５－Ｆｕ的作用；形态学见凋亡细胞呈荧光标记阳性，细胞内出现斑块状荧光，体积缩小。结论Ａｓ２Ｏ３可诱发胃癌细胞凋亡，有必要进一步探索其对胃癌治疗的价值。