SD大鼠成骨细胞培养方法的改良

目的:建立大鼠成骨细胞的分离、培养方法,并进行改良。方法:分别应用酶消化法、传统的植块法和采用胶原酶消化结合骨片贴附法进行成骨细胞原代培养,通过细胞形态学、Von Kossa钙结节染色和免疫印迹对细胞纯度进行鉴定,通过生长曲线对3种方法取得的原代细胞生长情况进行比较。结果:3种培养方式均可获得高纯度成骨细胞,应用胶原酶消化结合骨片贴附法可以长期获得具有稳定生物学特征的成骨细胞。结论:胶原酶消化结合骨片贴附法可以较长期获得高纯度成骨细胞。     

比较两种非贵金属烤瓷熔附金属对犬牙龈组织形态学的影响

目的:比较镍铬合金和钛合金两种非贵金属烤瓷修复体(PFM)对犬牙龈组织形态学影响.方法:将健康犬以镍铬合金和钛合金两种PFM修复体进行犬牙修复术,通过光镜和透射电镜观察犬牙龈组织的超微结构,用TUNEL方法检测细胞凋亡,并进行统计学分析.结果:镍铬合金PFM修复后,犬牙龈组织在光镜下可见大量的炎性细胞浸润,局部血管出血.凋亡指数58.63%±11.12%.钛合金PFM修复犬牙后,牙龈组织在光镜下炎性细胞浸润及局部血管出血较少,凋亡指数43.34%±8.27%.镍铬合金PFM与钛合金PFM的凋亡数与对照组差异具有统计学意义,镍铬合金PFM和钛合金PFM细胞凋亡数量差异有统计学意义,但镍铬合金凋亡指数更高.结论:镍铬合金PFM修复犬牙对犬牙龈组织影响大,而钛合金PFM修复犬牙对犬牙龈组织结构的影响相对较小,细胞凋亡指数较镍铬合金组低.临床上选择PFM修复时,选择钛合金制作PFM基底冠更有利于维护牙龈组织的健康.     

P53在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用

目的 探讨P53在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用.方法 将培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞随机分为4组:对照组、P53抑制剂组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L,P53抑制剂浓度为50μmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度为25mmol/L)和高糖+P53抑制剂组(P53抑制剂浓度为50μmol/L).噻唑盐比色法(MTT法)检测心肌细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot对各组细胞P53、BAX和Caspase-3进行半定量分析.结果 与对照组相比,高糖组心肌细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,Caspase-3、BAX和线粒体蛋白P53表达增多.与P53抑制剂组相比,高糖组心肌细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,Caspase-3、BAX和线粒体蛋白P53表达增多;高糖+P53抑制剂组心肌细胞活力也有所降低,凋亡率升高,Caspase-3、BAX和线粒体蛋白P53表达增多.与高糖组相比,高糖+P53抑制剂组的心肌细胞活力增高,凋亡率明显降低,Caspase-3、BAX和线粒体蛋白P53表达减少.结论 高糖可能通过介导P53转位到线粒体激活凋亡通路,引起心肌细胞凋亡.     

大鼠肌源性干细胞植入糖尿病鼠胰腺后的存活能力及血糖调节

背景:肌源性干细胞易于提取、分离及扩增,在特定条件下可分化为骨软骨、肌肉等中胚层组织细胞,还可以跨胚层分化为神经细胞等.目的:观察糖尿病鼠胰腺内植入的肌源性干细胞存活情况,及其调节血糖的效果.设计,时间及地点:细胞学体外观察,于2007-04/09在辽宁医学院科学实验中心完成.材料:SPFNAF级新生5d龄SD大鼠31只,由辽宁医学院实验动物中心提供.造模使用的链脲佐菌素为星隆达公司产品.方法:取5只大鼠的前肢肱三头肌与后肢腓肠肌,采用差速贴壁法纯化扩增大鼠肌源性干细胞,传至第3代用于移植,临用前以携带绿色荧光蛋白的腺病毒悬液进行转染.取20只大鼠,通过尾静脉注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,15只成功造模,取12只随机均分为2组:细胞移植组胰腺被膜下移植肌源性干细胞约2×106个,模型对照组同法给予等量不含细胞的培养液.余6只大鼠作为正常对照组.主要观察指标:肌源性干细胞移植至胰腺后的存活情况.移植后大鼠血糖浓度的变化.结果:移植后1周,胰腺组织争网架样结构,表达较强的黄绿色荧光;4周后仍有荧光表达,但强度减弱.与模型对照组比较,移植前2d细胞移植组大鼠血糖浓度无明显差异(P>0.05);移植后4,8d,大鼠血糖浓度一直处于较高水平;至移植后第4,8周大鼠血糖浓度明最下降(t=-2.416-8.372,P<0.01).结论:肌源性干细胞移植后能在糖尿病模型鼠的胰腺部位存活,且一定程度上可下调大鼠血糖浓度.     

专业型医学研究生的临床思维培养

在硕士研究生不断扩招的背景下,临床医学专业型硕士研究生的临床思维的培养也经受着前所未有的考验。本文简要分析了造成研究生临床思维能力欠缺的原因,并结合笔者所在学校的硕士研究生教育的一些体会,对当代医学研究生的临床思维的培养提出了一些新的见解。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养贴壁分离和消化控制相结合可否为简便高效的技术方法

目的:对骨髓间充质干细胞的培养一般采用流式细胞仪分离法及密度梯度离心法和免疫磁珠分离法,本实验观察了采用贴壁分离和消化控制相结合方法分离纯化的可行性。方法:实验于2004-09/12在锦州医学院附属第一医院外科实验室完成。选取6～8周龄的SD大鼠,雌雄不限,从其股骨、胫骨中取材,在无菌条件下操作,用剪刀分别剪去股骨胫骨的两端,暴露骨髓腔,用含有体积分数为0.15的胎牛血清Dulbecco改良培养基从骨髓腔中冲出骨髓于平皿中,用含有体积分数为0.1的胎牛血清的Dulbecco改良培养基培养,用消化控制及贴壁分离法分离纯化骨髓间充质干细胞,并观察其生长状态,测定骨髓间充质干细胞的生长曲线,分裂指数,贴壁率,用免疫细胞化学方法对骨髓间充质干细胞进行表型分析。结果:原代培养的骨髓间充质干细胞呈椭圆型、短梭型、长梭型、多角型等。纯化、扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭型,第6代前生长性状稳定,增殖能力强。传代周期为7d,每次传代时细胞活力测定均>97%,传代后24h内贴壁率99%。免疫细胞化学检测第3代细胞均匀表达CD54(ICAM-1)、纤维连接蛋白。结论:实验建立了一种可行的大鼠骨髓间充质干细胞取材、纯化、扩增方法。培养的骨髓间充质干细胞纯度高,细胞活力强,生物学性状稳定。本实验通过贴壁分离和消化控制相结合的培养方法具有操作简便,条件要求低等优点,是目前一种比较理想的分离纯化方法。     

酶组织化学法观察缺血预处理对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的:采用酶组织化学法观察缺血预处理对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤是否有保护作用。方法:实验于2005-07/10在锦州医学院药理实验室完成。选取健康清洁级1月龄SD大鼠24只,随机分为3组:假手术对照组、缺血再灌注组、经典缺血预处理组,8只/组。①缺血再灌注组和经典缺血预处理组大鼠建立骨骼肌缺血/再灌注模型。大鼠腹腔麻醉后沿股鞘切开皮肤,分离股动静脉,制成切断患肢皮肤、肌肉和神经,仅保留股动静脉,用微血管夹阻断股动脉血供,制成右后肢缺血模型。②缺血再灌注组大鼠造模后缺血60min,再灌注20min。经典缺血预处理组大鼠用无创伤血管夹阻断股动静脉,给予10min的短暂缺血及10min的再灌注,3次循环后再次阻断股动静脉,缝合左大腿前方皮肤切口,缺血60min,剪开左大腿前方切口取出无创伤血管夹,观察血流恢复无血栓形成后,在动脉血流恢复的情况下可观察到患肢鼠爪由暗紫色转变为粉红色,再灌注20min。假手术对照组大鼠只穿线不结扎,股动脉旷置50min。③通过光镜观察各组骨骼肌结构的变化,同时以黄嘌呤氧化酶法测定各组大鼠骨骼肌组织的超氧化物歧化酶活性,硫代巴妥酸法测定丙二醛含量,酶组织化学法测定过氧化氢酶活性和琥珀酸脱氢酶活性。结果:实验选取健康清洁级SD大鼠24只,全部进入结果分析。①造模后光镜下各组大鼠肌细胞形态学观察结果:假手术对照组肌细胞正常,肌纤维完整;缺血再灌注组肌细胞部分溶解,肌纤维扭曲、断裂;经典缺血预处理组肌细胞点片状坏死,肌纤维基本完整。②各组大鼠血清丙二醛和总超氧化物歧化酶含量的比较:与缺血再灌注组比较,经典缺血预处理组的血清丙二醛含量明显降低[(11.22±0.94),(7.67±1.21)μmol/L,P<0.05],血清总超氧化物歧化酶含量明显升高[(97.97±7.71),(145.74±11.07)Nu/mL,P<0.05]。③各组大鼠骨骼肌过氧化氢酶和琥珀酸脱氢酶活性的变化:与缺血再灌注组比较,经典缺血预处理组过氧化氢酶和琥珀酸脱氢酶活性均明显升高[(10423.4±3357.4),(28410.2±2925.3)个,P<0.05;(44.30±9.75),(63.00±9.72)A,P<0.05]。结论:大鼠骨骼肌组织在缺血前给予缺血预处理,能够增强骨骼肌的抗氧化能力,提高骨骼肌对缺血再灌注损伤的耐受程度。提示酶组织化学法可以较准确地反映缺血预处理具有保护心肌结构和抗氧化效应。     

锦州地区青少年椎间盘突出危险因素的logistic回归分析

背景：成人与青少年椎间盘突出的发病机制和危险因素差别很大,国内应用logistic回归分析青少年椎间盘突出危险因素的研究较少。 目的：多因素非条件Logistic回归分析锦州地区青少年椎间盘突出发病的危险因素。 方法：选择青少年椎间盘突出患者94例作为实验组,男56例,女38例;年龄9~18岁。居住地为锦州市。对照组患者选自同期因其他非椎间盘突出疾病入院的同年龄组同居住地患者共100例。采用多因素非条件Logistic回归分析对椎间盘突出发病的可能相关因素进行分析,以OR > 1为椎间盘突出发生的危险因素：OR < 1为椎间盘突出发生的保护因素。 结果与结论：194例患者均进入结果分析。多因素非条件Logistic回归分析显示：与对照组相比,椎间盘突出患者家族遗传OR =6.427,P=0.015;创伤因素OR=17.196,P=0.011;先天畸型 OR=31.429,P=0.002;运动过量OR=12.644,P=0.027。结果表明,家族遗传、创伤、先天畸型和运动过量是锦州地区青少年椎间盘突出发病的危险因素。以此为依据制定相应的预防方案十分必要。     

前列地尔预处理对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的早期和延迟性保护效应

背景:研究证实缺血预处理对于心肌具有抗缺血再灌注损伤的保护作用.近来实验显示缺血预处理对于骨骼肌具有保护作用.目的:比较前列地尔预处理及经典缺血预处理对在体大鼠骨骼肌缺血/再灌注损伤的早期和延迟保护效应.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-03/10在辽宁医学院附属第一医院实验室完成.材料:前列地尔脂肪乳剂由北京泰德制药有限公司提供;实验动物选用健康雄性的SD大鼠30只,体质量(275±25)g.方法:30只大鼠制成切断患肢皮肤、肌肉和神经,仅保留股动静脉的动物模型,随机均分成5组.假手术对照组:只穿线不结扎,股动脉旷置50 min;缺血再灌注组:缺血60 min,再灌注20 mira经典缺血预处理组,缺血前反复4个循环的缺血5 min/再灌注5 min;前列地尔预处理早期保护组:缺血前5 min经尾静脉注射前列地尔2 mL(剂量0.50 ug/kg);前列地尔预处理延迟保护组:缺血前24 h尾静脉注射前列地尔2 mL(剂量0.50 u g/kg).主要观察指标:光镜观察骨骼肌结构的变化,同时用黄嘌呤氧化酶法测定血清的超氧化物歧化酶活性和用硫代巴妥酸法测定丙二醛含量.酶组织化学法测定过氧化氢酶活性.测定血清诱导型一氧化氮合酶和一氧化氮活性.结果:与缺血再灌注组相比,前列地尔预处理及经典缺血预处理均有保护骨骼肌超微结构和抗氧化效应,经典缺血预处理组、前列地尔预处理早期保护组及延迟保护组明显降低缺血再灌注后的骨骼肌丙二醛浓度(P<0005)和升高超氧化物歧化酶活性(P<0.05),过氧化氢酶活性(P<0.05)、一氧化氮合酶和一氧化氮活性(P<0.05).结论:前列地尔预处理对在体大鼠骨骼肌缺血,再灌注损伤具有早期和延迟保护效应,能模拟经典缺血预处理骨骼肌保护效应,且早期保护作用强于延迟作用,一氧化氮参与延迟保护机制.     

化学萃取的异种神经修复神经缺损的可行性研究

目的 探讨联合应用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)的化学萃取方法,对异种神经移植段进行脱细胞处理,构建异种神经去细胞基质膜管,应用于修复周围神经缺损的可行性.方法 取新鲜兔坐骨神经,切成长10mm的神经段,用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)反复处理新鲜的兔神经段构建成异种神经去细胞基质膜管,修复大鼠坐骨神经缺损.结果 4个月后异种神经基质膜管与大鼠坐骨神经缝合处愈合良好,未见有神经瘤及粘连,HE染色显示异种神经基质膜管组桥接处再生神经结构连续性良好,移植段可见神经纤维及新生的血管.S-100免疫组织化学染色可见阳性的雪旺氏细胞沿神经纤维分布成条带状.电镜超微结构观察可见再生的神经纤维较粗大,排列紧密,呈均匀一致圆型或椭圆型,髓鞘较厚,轴突结构完整.结论 联合应用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)的化学萃取方法构建的异种神经去细胞基质膜管可以修复大鼠坐骨神经缺损.