透明质酸凝胶中肌源性干细胞与透明软骨联合培养的实验研究

 摘　要：目的 探讨肌源性干细胞与软骨细胞混和培养体外成软骨的可行性。方法 分离培养、扩增传代兔MDSCs及关节软骨细胞,二者按一定比例混和,6×1010/L密度接种于5%浓度的透明质酸凝胶为共培养组,以相同密度的单纯MDSCs和单纯软骨细胞作为阴性与阳性对照。倒置相差显微镜下观察,10d后行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学检测,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA表达。结果 5d后镜下见共培养组MDSCs形态由梭形向多边多角形转化,10d后细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测与阳性对照组相同,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达。阴性对照组在体外培养过程中未分化为软骨细胞. 结论:软骨微环境在MDSCs成软骨分化过程中具有重要作用,软骨细胞能有效地诱导MDSCs向软骨样细胞分化,透明质酸凝胶可以作为软骨组织工程的良好载体。     

活性氧激活线粒体凋亡通路介导高糖诱导心肌细胞凋亡的研究

目的探讨氧化应激和p53介导的线粒体凋亡通路在高糖诱导乳鼠心肌细胞凋亡的作用。方法将培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞随机分为四组：对照组、高糖组（葡萄糖浓度为25mmol/L）、高糖＋抗氧化剂组（抗氧化剂浓度为10mmol/L）和高糖＋p53抑制剂组（p53抑制剂浓度为50μmol/L）。荧光分光光度计检测细胞内的活性氧,分光光度计检测上清液中的超氧化物歧化酶,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot对各组细胞p53和Caspase-9进行半定量分析。结果与对照组相比,高糖组心肌细胞凋亡率（P〈0.01）和ROS明显升高（P〈0.01）,上清液中的SOD含量明显降低（P〈0.01）,Caspase-9（P〈0.01）和线粒体蛋白p53表达增多（P〈0.01）。与高糖组相比,高糖＋抗氧化剂组心肌细胞凋亡率（P〈0.01）和ROS明显降低（P〈0.01）,上清液中SOD明显升高（P〈0.01）,Caspase-9（P〈0.01）和线粒体蛋白p53表达减少（P〈0.01）。与高糖组相比,高糖＋p53抑制剂组的心肌细胞凋亡率（P〈0.01）和ROS明显降低（P〈0.05）,上清液中SOD含量升高（P〈0.05）,Caspase-9（P〈0.01）和线粒体蛋白p53表达减少（P〈0.01）。结论高糖可能通过产生的活性氧介导p53转位到线粒体激活线粒体凋亡通路,引起心肌细胞凋亡。     

新冠肺炎疫情背景下医学类独立学院线上教学改革探索

为确保新冠病毒肺炎疫情期间学院师生员工身体健康和生命安全,充分做好延后返校的应对准备,最大程度降低疫情对新学期教学进度的影响。锦州医科大学医疗学院根据学院教学规模、条件,全面统筹各方力量,整合调集教育资源,经过多方研讨科学制定线上教学方案,进行线上教学改革,利用网络教学工具开展疫情期间教学活动,切实做到"延期不延教、停课不停学"。     

细胞移植治疗脊髓损伤

细胞移植治疗脊髓损伤，使损伤轴突修复、再生和恢复脊髓部分神经功能成为可能，但神经膜细胞移植后轴突再生仅能在移植范围内生长，不能重新进入到正常脊髓组织内。少突胶质细胞对先迁移的轴突无方向诱导作用，不能形成轴突迁移的引导通道，从而导致轴突生长迁移“迷路”。胚胎神经干细胞替代损伤、死亡的神经元，重建神经元回路是有作用的，但考虑到伦理学、法律以及组织相容性和胚胎的来源，其临床应用目前还受到限制。嗅鞘细胞移植不仅可明显促进脊神经轴突的生长。而且脊髓还有良好的功能恢复。但嗅鞘细胞在活体上只能在嗅黏膜上获得，数量较少，而且成熟动物的嗅鞘细胞增殖能力有限。骨髓基质细胞来源广泛，取材方便，分离培养容易，且骨髓基质细胞易于外源基因的导入和表达，可为基因治疗神经系统的疾病提供良好的载体。如果骨髓基质细胞向神经细胞转化移植成功，患可以利用自身的骨髓基质细胞体外培养扩增，用于脊髓损伤的治疗，恢复神经系统的正常功能。     

SD大鼠肋软骨细胞的原代培养和去分化现象的观察

目的建立大鼠肋软骨细胞（RCC）分离、培养的方法,探讨其传代过程中细胞外基质及其形态的变化。方法采用胰酶和II型胶原酶两步消化法结合机械吹打获得分散的单个RCC,观察单层培养的不同代数RCC的细胞形态变化;采用免疫细胞化学方法检测不同代数RCC蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达。结果大鼠肋软骨经两步消化后,可获得高纯度的软骨细胞,经免疫组化及甲苯胺蓝染色呈阳性结果,同时观察到RCC在传代过程中细胞发生了去分化现象。结论软骨细胞可以通过传代培养获得扩增,但仅限于四代以内细胞。     

骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后COX-2基因表达的影响

目的观察骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）移植对大鼠脊髓损伤后COX-2 mRNA表达的影响。方法分离培养BMSCs并传代。取Wistar雌性大鼠72只随机分为3组：A组18只（假手术组）、B组27只（细胞培养基对照组）和C组27只（BMSCs组）。B组和C组脊髓损伤后进行DMEM或BMSCs损伤周围区注射。应用RT-PCR法和免疫荧光方法检测损伤脊髓组织内COX-2 mRNA的表达及COX-2蛋白分布情况。结果 COX-2 mRNA在A组大鼠脊髓组织中低水平表达。脊髓损伤移植术后,C组COX-2 mRNA表达水平均显著高于相应时间点的B组（P〈0.01）。免疫荧光结果显示,A组COX-2仅表达于脊髓内的血管。脊髓损伤后,B组和C组COX-2表达分布则发生变化,主要见于损伤周围区脊髓内的血管和少数脊髓腹侧灰质内的神经元。结论 BMSCs移植能够增加脊髓损伤后COX-2 mRNA的表达。     

骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

目的 研究骨髓基质细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后神经细胞凋亡的影响,探讨骨髓基质细胞移植治疗脊髓损伤的机制.方法 取大鼠股骨和胫骨骨髓培养BMSCs并传代.参照Taoka's方法制作大鼠脊髓压迫损伤模型.脊髓损伤后30 min,进行BMSCs或DMEM培养液损伤周围局部四点注射.在术后3、7和14 d,应用TUNEL方法检测脊髓损伤周围神经细胞凋亡情况.结果 脊髓损伤后,损伤区周围组织内TUNEL阳性细胞数量明显增加,阳性细胞分布于脊髓灰质和白质内,但以白质内神经细胞为主.与DMEM组大鼠相比,移植术后3、7和14 d,BMSCs移植显著减少脊髓损伤周围区凋亡的神经细胞数目(P＜0.05).结论 脊髓损伤后,BMSCs移植能够抑制神经细胞凋亡.     

BMP-2诱导肌源性干细胞转化为软骨样细胞的体外实验研究

目的 体外定向诱导大鼠肌源性干细胞(MDSCs)向软骨细胞转化,并对诱导细胞进行鉴定.方法 用差速贴壁的方法对SD大鼠MDSCs进行分离和培养.用骨形态发生蛋白2(BMP2)将MDSCs进行诱导分化,9 d后取出标本,行甲苯胺蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.RT-PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖(aggrecan)的mRNA表达.结果 5 d后镜下见细胞形态由梭形向多边多角形转化.9 d后诱导组甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化检测阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达.结论 BMP-2可诱导MDSC向软骨细胞转化.     

新一代全陶瓷界面的全髋关节置换术治疗囊内移位的股骨颈骨折近期疗效观察

目的探讨新一代全陶瓷界面的全髋关节置换术（total hip arthroplasty,THA）治疗囊内移位的股骨颈骨折的近期疗效。方法 2009年1月-2012年6月,我科对37例37髋囊内移位的股骨颈骨折患者行新一代全陶瓷界面的THA。利用Harris评分标准对术后髋关节功能进行评价,并观察是否存在异响。通过骨盆正位X线片,测量髋臼外展角和前倾角估算,同时观察有无脱位、陶瓷组件碎裂、骨溶解、假体松动等情况发生。结果术后患者均获随访,平均随访2年4个月。末次随访时Harris髋关节评分为89~100分。影像学检查显示髋臼外展角42°~44°,前倾角16°~22°。随访期间未发现脱位,无陶瓷组件碎裂,无骨溶解和假体松动情况发生,1例术后7个月短暂时间出现髋关节异响,避免过度活动后异响消失,关节功能良好。结论新一代全陶瓷界面的THA治疗囊内移位的股骨颈骨折的近期疗效满意。     

肌源性干细胞移植修复糖尿病胰岛功能的旁分泌机制研究

目的阐明肌源性干细胞移植修复糖尿病小鼠胰岛功能的旁分泌机制及参与胰岛修复的信号通路。方法取6只大鼠的前肢肱三头肌与后肢腓肠肌,采用差速贴壁法纯化扩增大鼠肌源性干细胞,传至第4代用于移植。取40只大鼠,通过尾静脉注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,32只成功造模,取24只随机均分为3组：实验a组胰腺被膜下移植肌源性干细胞约2×106个,实验b组胰腺被膜下移植（LY294002（10umol/L）＋MD-SCs2×106）,模型对照组同法给予等量不含细胞的培养液。余8只大鼠作为正常对照组。结果血糖变化：移植后1周,实验a组血糖出现显著下降并一直持续下降至第4周,与模型对照组比较差异有统计学意义。胰岛细胞和胰岛β细胞数变化：移植后4周模型对照组胰岛数目仍较少,胰岛β细胞也较少,实验a组小鼠胰岛数目增加,胰岛β细胞数目也增加,与模型对照组比较差异有显著统计学意义。Western Blotting检测发现实验a组pAKT表达显著上调,加入LY294002后即使加入MDSCs后也不能上调pAKT。结论肌源性干细胞移植在糖尿病大鼠胰腺被膜下对胰岛功能有修复作用。