结核分枝杆菌6 kD早期分泌靶抗原单克隆抗体的制备及其特异性分析

目的 制备结核分枝杆菌(Mtb)6 kD早期分泌靶抗原(ESAT-6)单克隆抗体(mAb)并分析其特异性。方法 用亲和层析法纯化目的蛋白ESAT-6,并用该蛋白免疫小鼠。分离免疫小鼠的脾细胞并与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌mAb的杂交瘤细胞系。制备腹水并纯化mAb。酶联免疫吸附试验法分析mAb亚类和相对亲和力,蛋白印迹法检测其特异性。结果 制备了可分泌ESAT-6抗体的杂交瘤细胞系,获得了纯化的mAb。mAb亚型为IgG1,相对亲和力为3.9×10^-5。该mAb可特异性识别Mtb的ESAT-6。结论 制备抗ESAT-6的mAb为ESAT-6用于结核病诊断与防治制剂及其机制研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B-ESAT-6融合蛋白重组耻垢分枝杆菌对小鼠的免疫原性研究

目的 评价表达Mtb Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌（Ag85B-ESAT-6-rM.s）在小鼠中的免疫原性。 方法 6周龄BALB/c小鼠经背部皮下注射1×10⁶ CFU（colony-forming unit,菌落形成单位）的Ag85B-ESAT-6-rM.s,同时设M.s免疫组（10只）、BCG免疫组（10只）、Ag85B-ESAT-6融合蛋白免疫组（10只）和生理盐水组（10只）。接种免疫后1～6周,尾静脉采血,检测小鼠外周血CD4⁺和CD8⁺ T细胞所占百分比;免疫后6周,MTS［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt］法检测小鼠脾淋巴细胞增殖和酶联免疫斑点检测（enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT）检测脾淋巴细胞分泌γ干扰素（interferon γ,IFN-γ）、白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）和白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）等细胞因子的水平。 结果 Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠后能够明显刺激小鼠外周血CD4⁺和CD8⁺ T细胞的产生,其所占百分比［（59.6±1.5）%］明显高于BCG免疫组［(48.8±2.3)%］（t=12.252,P<0.05）和原始M.s免疫组［(45.7±1.6)%］（t=20.166,P<0.05）。Ag85B-ESAT-6-rM.s免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖指数（3.23±0.31）与BCG免疫刺激的增殖指数（2.95±0.36）相当（t=1.864,P>0.05）,但其诱生IFN-γ的能力［斑点形成细胞(spot forming cells,SFC) ］［(167.5±36.6)SFC/10.6］明显高于BCG［(98.5±26.9)SFC/10⁶ ］（t=4.804,P<0.05）。 结论 Ag85B-ESAT-6融合蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达能够明显提高M.s的免疫原性,并能够刺激小鼠机体产生有利于抗Mtb感染的免疫反应,作为TB新型候选疫苗具有一定的研究前景。     

结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体.方法:PCR扩增Rv2389基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染CHO细胞后, 分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果:构建了重组质粒pCDNA- Rv2389, RT-PCR结果证明Rv2389可在CHO细胞中转录,间接免疫荧光检测证明,表达有Rv2389蛋白的细胞着染.结论:成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pCDNA-Rv2389,Rv2389基因可以在CHO细胞中表达.     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64单克隆抗体的制备及其特异性

目的 制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并分析mAb的特异性。方法 PCR扩增mpt64基因并克隆入pET28a(+)构建原核表达载体;将获得的重组菌株在IPTG作用下诱导表达MPT64蛋白,Western blot验证蛋白表达;亲和层析法纯化目的蛋白。重组MPT64蛋白免疫小鼠,取脾细胞与杂交瘤细胞SP2/0融合,筛选得到阳性杂交瘤细胞系。以该杂交瘤细胞制备小鼠腹水,中压液相色谱仪纯化腹水获得mAb。ELISA法检测获得的mAb的相对亲和力和亚类,Western blot检测mAb的特异性。结果 本研究成功构建原核表达载体pET28a(+)-mpt64并诱导表达了MPT64蛋白。亲和层析法获得纯化的重组MPT64蛋白。该重组蛋白免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合后,经筛选获得能够稳定分泌抗MPT64 mAb的杂交瘤细胞系MPT64-A5B2。中压液相色谱仪纯化小鼠腹水中的MPT64-A5B2 mAb。该mAb的亲和力为2.813×10^-7 g/mL,属于IgG 1亚类。MPT64-A5B2 mAb能特异性识别Mtb中的MPT64蛋白。结论 本研究制备了MPT64重组蛋白,并获得了抗MPT64 mAb,为MPT64用于结核病诊断和治疗制剂的研制奠定了基础。     

分枝杆菌计数方法的比较研究

目的:建立牡牛分枝杆菌的快速检测方法.方法:采用紫外分光光度计法、测湿重法、平板菌落计数法测定细菌数,建立紫外分光光度计法、测湿重法对平板菌落计数法的标准曲线.结果:建立了紫外分光光度计法和湿重法相对于平板计数法的标准曲线,通过准确度分析表明在细菌含量在每毫升105～108之间时,两标准曲线线性关系良好.结论:该方法可用于牡牛分枝杆菌的快速计数.     

表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫原性

目的:研究表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对结核分枝杆菌(MTB)感染小鼠的保护能力.方法:以100 μg重组质粒pcDNA-e6c10接种BALB/c小鼠腓前肌,共免疫3次. 末次免疫结束2 wk后,检测免疫小鼠特异性抗体滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤效应以及诱导IFN-γ和IL-2水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠以1×105 MTB毒株H37Rv经尾静脉进行攻击,4 wk后计数脾脏细菌负荷数,观察免疫小鼠对MTB抵抗作用.结果:表达ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 800. 淋巴细胞刺激增殖指数为2.42±0.13,显著高于生理盐水对照组;免疫小鼠诱导IFN-γ含量(2449±12)ng/L与卡介苗(BCG)组无明显差异,IL-2含量(198±16)ng/L不及BCG免疫组,但显著高于生理盐水对照组;同时融合蛋白诱导的CTL杀伤率为42%. 与生理盐水免疫组(细菌负荷6.51±0.13)相比较,DNA疫苗免疫的BALB/c小鼠对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有较明显抵抗作用(细菌负荷4.51±0.23,P＜0.05),但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷无明显减少.结论:表达ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗能在结核病预防中有一定免疫治疗作用.     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性

目的　研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85 B的免疫学特性 .方法　用原核表达的 Ag85 B蛋白免疫 BAL B/c小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测 IFN- γ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 Ag85 B免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答 ,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞的增殖较显著 . MTT方法检测 Ag85 B免疫小鼠的 IFN-γ量为 96 0pg· L- 1 ,而生理盐水对照组的量低于 80 pg· L- 1 .结论　Ag85 B有可能作为新型结核疫苗的组分     

结核分枝杆菌MPT64-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力

目的:测定MPT64与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力. 方法:将MPT64与ESAT6的融合蛋白皮下免疫小鼠3次,每次间隔2 wk,ELISA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度. 最后一次免疫完成后4 wk,分离部分免疫小鼠脾淋巴细胞,MTT法检测淋巴细胞刺激指数,ELISA检测悬液中IFN-γ水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4 wk后计数脾脏细菌负荷数. 结果:MPT64-ESAT6融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度1∶ 1500,免疫小鼠后淋巴细胞刺激增殖指数为2.23,而生理盐水免疫组只有0.88;脾淋巴细胞悬液中诱发的IFN-γ为(4.28±0.27)μg/L,显著高于生理盐水免疫组[(0.48±0.17) μg/L,P<0.05],但不及BCG免疫组[(5.18±0.31)μg/L]. 与生理盐水免疫组(细菌负荷6.45±0.17)相比较,融合蛋白免疫的小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用,细菌负荷为5.04±0.11,但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微(细菌负荷4.38±0.22). 结论:MPT64与ESAT6融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.     

重组耻垢分枝杆菌Ag85B-ESAT6-rMs对小鼠巨噬细胞功能的影响

目的:探讨重组耻垢分枝杆菌Ag85B-ESAT6-rMs对小鼠巨噬细胞功能的影响。方法:将耻垢分枝杆菌(Ms)与重组耻垢分枝杆菌Ag85B-ESAT6-rMs分别感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,通过抗酸染色和细胞内细菌菌落形成单位计数评价Ms和Ag85B-ESAT6-rMs被巨噬细胞吞噬和消化能力;采用流式细胞术检测巨噬细胞凋亡情况;分别采用实时定量PCR技术和ELISA检测细胞因子TNF-α的表达和分泌水平。结果:小鼠巨噬细胞实验证实,Ag85B-ESAT6-rMs比Ms具有更强的感染和促进巨噬细胞的吞噬能力,Ag85B-ESAT6-rMs可增加巨噬细胞表达和分泌TNF-α的水平,并促进受感染巨噬细胞的凋亡。结论:Ag85B-ESAT6-rMs可以促进巨噬细胞的吞噬消化功能,将有助于增强巨噬细胞对Ms抗原的递呈和机体抗Ms感染的特异性免疫。     

提高医学微生物学实验课效果的几点作法

本着重讨论如何将微生物学实验课教学与课外兴趣小组的活动相结合，在加强基本素质训练的基础上。进一步培养创新能力和创新精神。