结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体.方法:PCR扩增Rv2389基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染CHO细胞后, 分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果:构建了重组质粒pCDNA- Rv2389, RT-PCR结果证明Rv2389可在CHO细胞中转录,间接免疫荧光检测证明,表达有Rv2389蛋白的细胞着染.结论:成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pCDNA-Rv2389,Rv2389基因可以在CHO细胞中表达.     

结核分枝杆菌Rv1009结构域多肽的免疫学特性研究

目的 研究结核分枝杆菌Rv1009结构域多肽的免疫学特性.方法 用原核表达的Rv1009结构域多肽免疫BALB/c小鼠3次.每次间隔2周.用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗体滴度.分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用抗原再刺激后,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖指数.ELISA方法检测淋巴细胞悬液中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-10和IL-12的产生水平.另一部分免疫的小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后,计数脾脏细菌负荷数.结果 Rv1009结构域多肽免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1:12 800.淋巴细胞增殖指数为2.40±0.18,明显高于生理盐水对照组的0.90±0.21.ELISA方法检测Rv1009结构域多肽免疫组IFN-γ、IL-10和IL-12水平为(1432±30)ng/L、(503±11)ng/L和(311±11)ng/L,显著高于生理盐水对照组的(256±20)ng/L、(76±6)ng/L和(56±8)ng/L(P<0.01).与生理盐水免疫组(细菌负荷6.64±0.13)相比较,Rv1009结构域多肽免疫组小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷为4.86±0.14,P<0.05),但不及BCG免疫组的3.81±0.16.结论 Rv1009结构域多肽有可能作为新型结核疫苗的候选组分.     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64单克隆抗体的制备及其特异性

目的 制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并分析mAb的特异性。方法 PCR扩增mpt64基因并克隆入pET28a(+)构建原核表达载体;将获得的重组菌株在IPTG作用下诱导表达MPT64蛋白,Western blot验证蛋白表达;亲和层析法纯化目的蛋白。重组MPT64蛋白免疫小鼠,取脾细胞与杂交瘤细胞SP2/0融合,筛选得到阳性杂交瘤细胞系。以该杂交瘤细胞制备小鼠腹水,中压液相色谱仪纯化腹水获得mAb。ELISA法检测获得的mAb的相对亲和力和亚类,Western blot检测mAb的特异性。结果 本研究成功构建原核表达载体pET28a(+)-mpt64并诱导表达了MPT64蛋白。亲和层析法获得纯化的重组MPT64蛋白。该重组蛋白免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合后,经筛选获得能够稳定分泌抗MPT64 mAb的杂交瘤细胞系MPT64-A5B2。中压液相色谱仪纯化小鼠腹水中的MPT64-A5B2 mAb。该mAb的亲和力为2.813×10^-7 g/mL,属于IgG 1亚类。MPT64-A5B2 mAb能特异性识别Mtb中的MPT64蛋白。结论 本研究制备了MPT64重组蛋白,并获得了抗MPT64 mAb,为MPT64用于结核病诊断和治疗制剂的研制奠定了基础。     

重组耻垢分枝杆菌Ag85B-ESAT6-rMs对小鼠巨噬细胞功能的影响

目的:探讨重组耻垢分枝杆菌Ag85B-ESAT6-rMs对小鼠巨噬细胞功能的影响。方法:将耻垢分枝杆菌(Ms)与重组耻垢分枝杆菌Ag85B-ESAT6-rMs分别感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,通过抗酸染色和细胞内细菌菌落形成单位计数评价Ms和Ag85B-ESAT6-rMs被巨噬细胞吞噬和消化能力;采用流式细胞术检测巨噬细胞凋亡情况;分别采用实时定量PCR技术和ELISA检测细胞因子TNF-α的表达和分泌水平。结果:小鼠巨噬细胞实验证实,Ag85B-ESAT6-rMs比Ms具有更强的感染和促进巨噬细胞的吞噬能力,Ag85B-ESAT6-rMs可增加巨噬细胞表达和分泌TNF-α的水平,并促进受感染巨噬细胞的凋亡。结论:Ag85B-ESAT6-rMs可以促进巨噬细胞的吞噬消化功能,将有助于增强巨噬细胞对Ms抗原的递呈和机体抗Ms感染的特异性免疫。     

提高医学微生物学实验课效果的几点作法

本着重讨论如何将微生物学实验课教学与课外兴趣小组的活动相结合，在加强基本素质训练的基础上。进一步培养创新能力和创新精神。     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性

目的　研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85 B的免疫学特性 .方法　用原核表达的 Ag85 B蛋白免疫 BAL B/c小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测 IFN- γ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 Ag85 B免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答 ,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞的增殖较显著 . MTT方法检测 Ag85 B免疫小鼠的 IFN-γ量为 96 0pg· L- 1 ,而生理盐水对照组的量低于 80 pg· L- 1 .结论　Ag85 B有可能作为新型结核疫苗的组分     

结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌免疫学特性

目的:研究结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫学特性.方法:用分泌表达MPT64的重组母牛分枝杆菌疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类.分离免疫小鼠脾淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-12产生水平、CD4+细胞和CD8+细胞数、脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应.毒株攻击后对脾脏细菌负荷计数.结果:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫可诱导小鼠高水平的体液免疫应答,免疫小鼠脾淋巴增殖明显,IFN-γ和IL-12含量增加,CD4+和CD8+细胞百分比明显增加,CTL杀伤效应明显,对MTB H37Rv攻击后有一定的保护作用.结论:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗可诱导小鼠有效的体液和细胞免疫应答,有可能作为新型TB疫苗候选.     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

结核分枝杆菌休眠相关抗原Rvl733cDNA疫苗的构建及免疫学特性研究

目的 构建结核分枝杆菌（Mtb）休眠相关抗原Rv1733c的真核表达载体,并评价其作为DNA疫苗的免疫学特性。 方法 利用限制性酶切的方法从本室前期保存的pMD-18T-Rv1733c质粒中构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c。将pcDNA-Rv1733c重组质粒稳定转染P815细胞,并用间接免疫荧光法检测Rv1733c的表达。采用数字表法随机将BALB/c小鼠分为3组,每组10只,即pcDNA-Rv1733c质粒DNA组、生理盐水组和BCG组。pcDNA-Rv1733c质粒DNA组和生理盐水组采用肌内注射方式免疫,间隔2周免疫1次,共免疫3次。BCG组采用皮下免疫一次。各组小鼠每2周采血,ELISA检测血清中特异性抗体水平和IgG2a/IgG1抗体亚类比率与比值。初次免疫8周后,MTS［3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium,inner salt］（四氮唑蓝盐化合物）法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖、ELISPOT检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平。流式细胞法检测脾淋巴细胞中CD4⁺和CD8⁺ T细胞所占比率;LDH法检测CTL（cytotoxic T lymphocytes;细胞毒性T淋巴细胞）活性。 结果 成功构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c。间接免疫荧光实验表明pcDNA-Rv1733c质粒稳定转染的P815细胞中能够稳定表达Rv1733c蛋白。pcDNA-Rv1733c质粒DNA免疫小鼠后能诱导小鼠产生特异性抗体,抗体亚类以IgG2a为主,随着免疫时间的延长,IgG2a/IgG1的比值趋于平衡;脾淋巴细胞增殖指数（2.00±0.36）高于BCG组（1.1±0.06）（t=3.096,P<0.05）;特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数(41.48±5.30) SFC/10⁶高于生理盐水组（2.75±1.37）SFC/10⁶（t=4.752,P<0.05）;然而脾淋巴细胞中CD4⁺、CD8⁺ T细胞所占比率［分别为(18.15±2.30)%、(7.68±1.34)%］、CTL杀伤活性［(29.52±1.96)%］都与生理盐水组相当［(16.43±2.02)% (t=0.571,P>0.05)、(7.32±0.42)% (t=0.234,P>0.05)、（25.28±2.51）%（t=0.726,P>0.05）］。 结论 成功构建Rv1733c真核表达载体pcDNA-Rv1733c;并能够诱导小鼠机体产生特异性的体液和细胞免疫应答,提示用于结核病新型疫苗的研究具有一定的意义。     

新型结核疫苗的研究进展

结核病是一种古老的疾病。据估计,全世界有1/3的人口感染结核分枝杆菌（mycobacterium tuber-culosis,MTB）,每年大约有200万结核病患者死亡,90%的感染者为潜伏感染,病原体以休眠的方式存在于机体内,约有10%的感染者为活动性结核患者。在一些发展中国家,对结核病的预防和治疗相当落后,结核病仍然阻碍社会经济的发展,新型结核疫苗