结核分枝杆菌EsxV亚单位疫苗黏膜免疫诱导的免疫应答

目的 研究结核分枝杆菌抗原Rv3619c(EsxV)黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答水平。方法 PCR法扩增esxV基因克隆入原核表达载体pET28a(+),获得的重组E.coli诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定蛋白的表达,亲和层析法纯化EsxV蛋白。以EsxV和/或联合环二腺苷酸(c-di-AMP)经鼻黏膜免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠特异性抗体水平及亚类,MTS法检测脾细胞增殖,qRT-PCR检测脾和肺脏细胞因子表达水平,ELISA法检测脾细胞因子分泌水平。结果 成功构建EsxV的原核表达载体pET28a(+)-esxV并诱导表达目的蛋白,亲和层析法获得了纯化的重组EsxV蛋白。EsxV经黏膜免疫可诱导显著的体液免疫应答,但诱导的细胞免疫应答水平不高。EsxV与c-di-AMP经黏膜接种可诱导特异性IgG水平增加,EsxV蛋白特异的脾细胞增殖,脾和肺细胞的IFN-γ转录增加。c-di-AMP显著提高EsxV特异的IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17细胞因子分泌,而不诱导炎症因子TNF-α和IL-6表达。结论 EsxV与c-di-AMP佐剂构建的亚单位疫苗可诱导特异性体液和细胞免疫应答,可进一步用于新型结核病亚单位疫苗的研制。     

藤黄微球菌Rpf结构域多肽诱导小鼠免疫应答的实验研究

目的:研究藤黄微球菌Rpf结构域多肽的免疫学特性.方法:用原核表达的藤黄微球菌Rpf结构域多肽免疫哌BALB/c小鼠3次,每次间隔2周.用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗体滴度.分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用抗原再刺激后,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增值指数.ELISA方法检测淋巴淋巴细胞悬液中IFN-γ、IL-10和IL-12产生水平.另一部分免疫的小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后,计数脾脏细菌负荷数.结果:藤黄微球菌Rpf结构域多肽免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶128 000,淋巴细胞增殖指数为(2.10±0.12),明显高于生理盐水对照组(0.90±0.21).ELISA方法检测Rpf结构域多肽免疫组IFN-γ,IL-10和IL-12水平为(1 126±36) ng/L,(368±13)ng/L和(289±14)ng/L,明显高于生理盐水对照组(P<0.01).与生理盐水免疫组(细菌负荷6.64±0.13)相比较,Rpf结构域多肽免疫的BALB/c小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有明显作用(细菌负荷为5.03±0.11,P<0.05).结论:藤黄微球菌Rpf结构域多肽有可能作为新型结核疫苗的候选组分.     

藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响

目的 表达纯化藤黄微球菌(Micrococcus luteus)复活促进因子(Rpf)及结构域(domain)蛋白,研究其对结核分枝杆菌牛长的影响.方法 诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT-Rpf和pPro-EXHT-Rpf domain,在变性条件下对目的 蛋白进行纯化.用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长.结果 获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95%和93%,相对分子质量(Mr)大小分别为30×103和12×103,蛋白质含量分别为471 mg/L和337 mg/L.Western blot证实,获得的蛋白为我们所需要的目的 蛋白.所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长,而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长.结论 表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长,而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性.     

抗藤黄微球菌Rpf结构域单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:克隆、表达藤黄微球菌Rpf结构域多肽,并制备针对该多肽的单克隆抗体(mAb).方法:采用聚合酶链反应(PCR)藤黄微球菌基因组中扩增出藤黄微球菌Rpf结构域基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC-19克隆载体中,测序正确后,再亚克隆到融合表达载体pPro-EXHT中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的Rpf结构域基因多肽,在变性条件下纯化目的蛋白.用纯化的目的蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,进行细胞融合、克隆化制备抗Rpf domain单抗(mAb),用ELISA法初步鉴定其特异性和相对亲和力.结果:在变性条件下用Ni2 -NTA亲和色谱柱纯化目的融合蛋白,纯化获得的蛋白纯度大于90%.用该融合蛋白免疫小鼠后,获得了3株抗Rpf domain mAb,这3株mAb均特异性识别Rpf domain多肽.结论:所获得的抗Rpf domain mAb特异性强、效价高,对进一步研究Rpf domain在结核病免疫预防中的作用提供了有力的工具.     

结核分枝杆菌亚单位疫苗Ag85b-ESAT-6+Hsp65-IL-2的安全性评价研究

目的评价结核分枝杆菌亚单位疫苗Ag85b-ESAT-6+Hsp65-IL-2在小鼠和豚鼠体内的安全性。方法小鼠慢性毒性实验:C57BL/6J小鼠间隔2周、皮下3次注射100 μg亚单位疫苗(Ag85b-ESAT-6和Hsp65-IL-2各50 μg),观察临床症状表现和器官病理学改变。小鼠急性毒性实验:C57BL/6J小鼠皮下注射100 μg 亚单位疫苗(Ag85b-ESAT-6和Hsp65-IL-2各50 μg),观察小鼠临床症状、体重、摄食摄水量、器官的脏器系数和病理学表现。豚鼠全身过敏实验:Hartley豚鼠间隔2 d、皮下3次注射1 000 μg、100 μg、10 μg亚单位疫苗(Ag85b-ESAT-6和Hsp65-IL-2均按质量1∶1混合),16 d后用二倍剂量足背静脉注射激发,观察体重变化和全身过敏症状。结果小鼠慢性毒性实验表明,亚单位疫苗多次注射后不引起临床症状和病理损伤;小鼠急性毒性实验表明,亚单位疫苗对小鼠不产生临床症状,对小鼠体重、摄食摄水量、脏器系数、器官病理学改变影响无统计学意义;豚鼠全身过敏实验表明,疫苗短期多次致敏对豚鼠的体重无明显影响,低剂量疫苗不引起豚鼠产生全身过敏反应。结论亚单位疫苗Ag85b-ESAT-6+Hsp65-IL-2在小鼠和豚鼠体内均表现出良好的安全性,可用于进一步TB预防和治疗性疫苗的研制。     

高校护理专业学员基础课学习状况的调查与研究

目的了解护理专业学员的基础课学习状况。方法采用文献资料法、问卷调查法、教师访谈法进行调查。结果大多数学员学习目的明确,但学习方法有待改进。教师在教学过程中影响较大。教学课程设置应针对专业特点更趋合理。教学效果考评方式应以闭卷和开卷考试结合的方式进行。结论此调查研究对护理专业的教学有一定的指导意义。     

结核分枝杆菌Rv1009基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌Rv1009基因真核表达载体。方法PCR扩增Rv1009基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染P815细胞后,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果构建了重组质粒pCDNA-Rv1009,RT-PCR结果证明Rv1009可在P815细胞中转录,用间接免疫荧光检测,表达有Rv1009蛋白的细胞着染。结论成功构建了结核分枝杆菌Rv1009基因的真核表达载体pCDNA-Rv1009,Rv1009基因可以在P815细胞中表达。     

融电子教案与传统教案于一体的新型电子教案的制作设计

利用Powerpoint2000的"备注"栏功能,将纸质文件教案的注释和内容等写入备注栏;利用计算机设置功能,把Win-dows桌面扩展到另一台监视器上。结果是教员使用的电脑显示器可以同时显示幻灯和备注内容,而学员观看的投影大屏幕上只显示幻灯内容,隐去备注内容,由此设计出集传统纸质教案与传统电子教案于一体的新型电子教案,极大的方便了教员上课,提高了教学效果,省时省力,具有推广使用前景。     

新型结核疫苗的研究进展

结核病是一种古老的疾病。据估计,全世界有1/3的人口感染结核分枝杆菌(mycobacterium tuber-culosis,MTB),每年大约有200万结核病患者死亡,90%的感染者为潜伏感染,病原体以休眠的方式存在于机体内,约有10%的感染者为活动性结核患者。在一些发展中国家,对结核病的预防和治疗相当落后,结核病仍然阻碍社会经济的发展,新型结核疫苗     

融合表达Ag85B-ESAT6的结核分枝杆菌真核表达载体的构建及其免疫原性

目的: 构建融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)分泌蛋白Ag85B-ESAT6真核表达载体,研究该重组载体在体外的表达和在小鼠体内诱生体液免疫应答的能力. 方法: 设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物,采用PCR的方法从MTB毒株H37Rv-DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段,将片段分别与pGEM-T-easy载体连接后测序. 将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3,挑选出阳性克隆,分别命名为AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF,将重组质粒电转CHO细胞,RT-PCR检测融合蛋白mRNA的表达,间接免疫荧光测定CHO细胞内融合蛋白的表达;用重组质粒免疫BALB/c小鼠,ELISA测定特异性抗体的滴度. 结果: PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与GenBank报道的一致. RT-PCR可检测融合基因转录出mRNA,转染重组质粒的CHO细胞内有较强的免疫荧光,AZ-pcDNA3-EF质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 1000,EZ-pcDNA3-AF质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 1500. 结论: Ag85B和ESAT6融合基因真核表达载体构建成功,有望为结核病的预防提供有效的基因疫苗.