乙型肝炎病毒X蛋白与细胞色素C氧化酶Ⅲ的特异性结合

目的 探讨HBV X蛋白与细胞色素c氧化酶Ⅲ(COXⅢ)之间的结合作用.方法 采用交合实验验证HBV X蛋白和COXⅢ在酵母细胞内的结合作用,利用离体结合实验证实两者在体外的结合作用,采用免疫共沉淀实验证实两者在哺乳动物细胞中的结合作用.结果 携带COXⅢ基因的酵母与携带X基因的酵母交合后发生反应,β-半乳糖苷酶(LacZ)活性检测菌落呈现蓝色,离体结合实验Western印迹中出现特异性结合活性反应条带,提示X蛋白和COXⅢ在体外存在直接相互作用,免疫共沉淀实验在相对分子质量为17 000处出现蛋白条带,提示在哺乳动物细胞水平仍能检测到X蛋白和COXⅢ的特异结合.结论 COXⅢ与X蛋白在原核细胞和哺乳动物细胞中均存在特异性结合,HBV可能通过此反应干扰线粒体呼吸链功能及能量代谢过程.     

乙型肝炎病毒X蛋白与细胞色素C氧化酶亚单位Ⅲ结合的定位研究

目的 探索细胞色素C氧化酶亚单位Ⅲ(COX Ⅲ)与乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的具体结合位点. 方法 构建pAS2-1-X变异体重组载体,醋酸锂转化法将其转入酵母细胞,通过PCR法及测序法证实目的片段转入酵母细胞;Western blot法明确变异体蛋白在酵母细胞中能否正确表达,滤膜转印法排除自身激活作用;固体培养基交合实验及β-半乳糖苷酶活性实验检测HBx和COX Ⅲ的结合区域. 结果 成功构建含HBx第1～ 72位氨基酸的变异体重组载体pAS2-1-X1和第1～ 117位氨基酸的变异体重组载体pAS2-1-X2,测序及PCR均证实片段的正确性.Western blot证实变异体蛋白在酵母细胞中可正确表达,且变异体蛋白无自身激活作用.交合实验及β-半乳糖苷酶活性检测将HBx和COX Ⅲ的结合区域定位于72 ～ 117位氨基酸. 结论 通过酵母双杂合实验证实HBx和COX Ⅲ的结合区域定位于72 ～ 117位氨基酸,此结合区域的明确有望帮助进一步阐明X蛋白在体内的作用机制,并可能为慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌的防治提供新思路.     

乙型肝炎病毒X基因在HepG2肝癌细胞的转染及对Fas/FasL表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因在HepG2肝癌细胞中的转染及对Fas/FasL表达的影响.方法用分子克隆方法构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,用脂质体转染方法瞬时转染HepG2细胞,以转染空载体pcDNA3的HepG2细胞及未转染质粒的HepG2为对照,抽提RNA,进行RT-PCR,检测HBV X基因的表达.以β-actin为内参,用半定量RT-PCR法检测三组细胞凋亡相关基因Fas/FasL mRNA相对表达量的变化.结果重组真核表达载体经RT-PCR及DNA测序均检测出HBV X特异性片段,pcDNA3-X转染HepG2细胞后,RT-PCR扩增出HBV X片段,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段.转染HBx的细胞Fas与FasL mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差别有统计学意义(P＜0.05).结论成功构建HBV X真核表达载体pcDNA3-X,转染入HepG2肝癌细胞,并在该细胞中表达.HBx在肝癌细胞中的表达能上调Fas和FasL基因的表达.     

靶向乙型肝炎病毒X蛋白小干扰RNA对稳定表达X基因的正常人肝细胞株线粒体功能的影响

目的 构建并鉴定靶向HBV X蛋白(HBx)小干扰RNA(siRNA)重组表达质粒,观察其对稳定表达HBx基因的正常人肝细胞株HL-7702/HBx线粒体功能的影响.方法 设计合成两条针对全长HBx基因具有短发夹结构的siRNA序列,克隆至载体psiRNA-Hh1GFPzeo中,构建重组表达质粒pX1和pX2,并以不针对任何序列的重组质粒pScr作为对照.通过脂质体介导转染人HL-7702/HBx肝细胞株,RT-PCR及Western印迹检测其对HBx的阻抑效应.流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)和线粒体膜电位(△ m)水平的变化.采用方差分析对实验结果进行统计分析.结果酶切鉴定和测序结果证实pX1和pX2构建成功.pScr、pX1、pX2分别转染入HL-7702/HBx细胞48 h后,空白对照组HBx mRNA和蛋白表达水平分别为0.65±0.12和0.62±0.09,pX1组分别为0.33±0.10和0.19±0.08,明显低于空白对照组(t=4.73,P<0.05;t=7.53,P<0.05),pX2组分别为0.48±0.10和0.37±0.11,亦明显低于空白对照组(t=2.39,P<0.05;t=4.43,P<0.05),但pX1组抑制效果强于pX2组(t=2.28,P<0.05).RNA干扰后细胞内ROD水平为5.00±0.38,△ m水平为33.86±0.50;空白对照组ROS为72.10±0.55,△ m为3.57±0.26(t=276.22,P<0.05;t=107.15,P<0.05).结论 靶向HBx的siRNA能特异性抑制HBx在HL-7702/HBx细胞中的表达,并降低细胞内ROS水平,提高△ m水平,减轻细胞内氧化应激反应.     

当您是第一目击人,应该怎么做？——学会简单的急救常识

如果身边的人突发心脏病,而您在现场,是第一目击人,您应该怎么做？——实施心肺复苏术（CPR）!     

乙型肝炎病毒前S1结合蛋白的筛选和鉴定

目的利用酵母双杂合体系筛选HBV前S1结合蛋白,进一步探讨前S1蛋白在HBV感染中的作用。方法PCR扩增HBV前S1基因序列,根据酵母双杂合体系构建饵质粒pAS2-1- preS1,并测定序列;饵质粒转化入酵母菌AH109,Western印迹法证实前S1-BD融合蛋白在酵母细胞中的正确表达。pAS2-1-preS1及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞,通过选择性培养及β-半乳糖苷酶活性测定筛选阳性菌落,分离实验排除假阳性克隆,扩增阳性克隆的目的基因并测定序列,查询其同源序列,行交合实验进一步证实目的蛋白同前S1蛋白在酵母细胞中能否特异性结合。结果成功构建pAS2-1-preS1饵质粒,Western印迹法证实转化饵质粒的酵母细胞能正确表达前S1- BD融合蛋白,pAS2-1-preS1及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后,选择性培养出101个菌落,经β-半乳糖苷酶活性测定及分离实验后筛选出1个阳性克隆,其cDNA插入片段与丝裂原活化蛋白激酶-胞外信号调节蛋白激酶(MAPK-ERK)激酶1(MEK1)基因高度同源。交合实验证实MEK1同前S1蛋白在酵母细胞中可特异性结合。结论酵母双杂合体系证实MEK1可能是一个前S1结合蛋白。     

内镜与X线联合放置食管支架治疗食管恶性狭窄初探

目的 探讨内镜联合X线放置食管支架治疗食管恶性狭窄的临床意义.方法 13例食管恶性狭窄患者采用内镜联合X线放置国产带膜网状镍钛合金记忆支架,规格为Ⅱ型,喇叭口或球头支架,架体直径18～20mm,支架有硅胶膜覆盖,支架置入器外径8mm,支架上下端各超出狭窄段2cm.结果 13例患者放置食管支架一次性成功,支架置入后梗阻即刻缓解,所有患者术后均有不同程度不适,2例患者疼痛较为激烈,发生率为15.4%(2/13);3例患者出现反流性食管炎,发生率为23.1%(3/13);5例患者发生术后再狭窄,发生率为38.5%(5/13).本组病例无一例发生术后大出血及支架移位,未发生食管穿孔等严重并发症.结论 内镜联合X线放置食管支架治疗食管恶性狭窄,使支架置入更加安全、准确和便捷,具有良好的临床应用价值.     

HBV X基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡的影响及其机制

目的:研究HBV X基因转染对HepG2肝癌细胞凋亡及凋亡相关因子表达的影响.方法:用脂质体转染法将HBx真核表达载体pcDNA3/HBx瞬时转入HepG2细胞,以未转染的HepG2细胞及转染空载体pcDNA3的细胞为对照.RT-PCR法检测HBx基因的表达;MTT法检测各组细胞的增殖活性;TUNEL法检测各组的凋亡情况.β-actin为内参,半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因Bax、Bcl-xL、c-myc的表达量变化.结果:pcDNA3-X转染HepG2细胞后,RT-PCR扩增出HBV X片段,空质粒组及正常对照组均未扩增出相应片段.HepG2细胞转染HBx基因后,相对于对照组细胞增殖能力明显下降,凋亡增多,差异有显著性意义(P＜0.01);转染HBx的细胞Bax、Bcl-xL、c-myc mRNA相对表达量较转染空质粒组和未转染质粒组明显增高,差异有显著性意义(P＜0.05).结论:成功将HBx基因转染入HepG2细胞,并在细胞中表达,转染HBx基因可同时上调Bax、Bcl-xL、c-myc mRNA表达,促进HepG2细胞凋亡,抑制增殖.     

乙型肝炎病毒PreS1蛋白与初期多肽相关复合体α亚单位特异性结合的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)PreSl蛋白与人类初期多肽相关复合体α亚单位(nascent-polypeptide-asso-ciated complex alpha polypeptide,NACA)之间的结合作用.方法 采用交合实验验证PreS1蛋白和NACA在酵母细胞内的结合作用,利用离体结合实验证实二者在体外的结合作用,免疫共沉淀实验证实二者在哺乳动物细胞中的特异性结合.结果 携带NACA基因的酵母同携带preS1基因的酵母交合后发生反应,LacZ活性检测菌落旱现蓝色,离体结合实验Western印迹中出现特异性结合活性反应条带,提示PreS1蛋白和NACA在体外存在直接相互作用,免疫共沉淀实验在13×lO~3处出现蛋白条带,提示在哺乳动物细胞水平仍能榆测到PreS1蛋白和NACA的特异结合.结论 NACA与PreS1蛋白在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在特异性结合,推测NACA可能通过与PreS1蛋白的结合影响病毒黏附及反式激活等过程.     

乙肝病毒X基因慢病毒载体的构建和鉴定

目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白的重组慢病毒载体pRRLsincPPT-hPGK-X-IRES-eGFP-WPRE(pRRL-X),并感染正常组织来源的人肝细胞HL-7702,以验证其在体外的感染效率.方法 采用PCR技术扩增出HBV X基因的DNA片段,用IN-Fusion技术构建表达载体pRRL-X并鉴定,j...