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腺病毒介导Cubilin反义RNA对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的抑制作用 总被引:2,自引:2,他引:0
目的构建细菌内同源重组型的Cubilin反义RNA腺病毒表达载体并研究其对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的影响.方法 PCR 扩增大鼠Cubilin起始编码区767 bp 的DNA 片段,与T载体连接,测序鉴定连接方向,通过选择反向和同向的双酶切位点与腺病毒穿梭载体pAdtack-CMV 同时酶切和连接,构建反向插入(正向插入作为对照)的腺病毒穿梭载体.将PmeⅠ线性化的腺病毒穿梭载体pAdtack-ACUB和pAdtack-CUB转染包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1 的受体菌BJ5183(AdEasyTMXL) 进行同源重组.用含有卡那霉素的LB 平板筛选同源重组阳性的克隆, PacⅠ酶切和测序鉴定后,转染包装细胞(293细胞),经病毒扩增和纯化后,再以OD 法和GFP 法计算重组腺病毒的滴度.经免疫印迹法分析Cubilin反义RNA 对Cubilin 蛋白质诱导表达的抑制作用.结果成功构建了Cubilin的反义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-ACUB)和对照正义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-CUB),滴度为2.0 ×1010pfu/ ml、1.8×1010pfu/ ml;Cubilin反义RNA腺病毒表达载体转染可明显抑制大鼠肾小管上皮细胞的Cubilin 蛋白的诱导表达.结论 Cubilin的反义RNA腺病毒表达载体的成功构建以及对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的明显抑制作用,为在基因水平的研究和治疗蛋白尿引起的肾间质损伤奠定了良好的基础. 相似文献
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慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是指肾脏损害(包括血、尿成分异常,或影像学检查、肾脏病理检查异常)时间≥3个月,可伴或不伴肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)异常.我国的CKD患病率为10.8%,患病人数达1.3亿[1],其中3%为育龄期女性[2... 相似文献
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目的 探讨人类血清白蛋白(HSA)超负荷损伤肾小管上皮细胞后对肾间质微血管损伤的影响及可能机制。 方法 激光共聚焦显微镜观察肾小管上皮细胞(HKC)吞饮罗丹明标记白蛋白(TRITC-BSA)以及吞饮受体cubilin siRNA对其的抑制效应。氢化乙锭标记的荧光探针检测白蛋白刺激HKC产生O2-以及白蛋白吞饮受体cubilin siRNA和线粒体呼吸链复合物I抑制剂鱼藤酮对HKC产生O2-的抑制作用。培养上清H2O2采用化学比色方法检测。倒置显微镜下观察HSA激活的HKC以及cubilin siRNA或鱼藤酮预处理的HKC与脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养后血管内皮管样结构形成情况。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定内皮细胞活力。用流式细胞仪以AnnexinV FITC/PI双染法检测内皮细胞凋亡率。 结果 (1)cubilin siRNA可显著抑制HKC吞饮白蛋白(P < 0.05)。(2)HSA刺激HKC产生 ROS呈剂量及时间依赖性(P < 0.05);cubilin siRNA及鱼藤酮均可抑制白蛋白超负荷诱导HKC产生大量ROS (P < 0.05)。(3)HKC与HUVEC共培养体系中,HSA活化的HKC抑制内皮细胞管样结构的形成,内皮细胞增殖显著减少(P < 0.05),细胞凋亡率显著增高(P < 0.05);而cubilin siRNA和鱼藤酮干预组内皮细胞管样结构数及内皮细胞活力显著增加(P < 0.05),细胞凋亡率显著降低(P < 0.05)。 结论 白蛋白可通过吞饮受体cubilin激活肾小管上皮细胞线粒体呼吸链复合物I产生大量ROS,后者可能是慢性肾病时大量蛋白尿活化肾小管上皮细胞进而损伤肾小管周微血管网的重要介质。 相似文献
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目的 观察马兜铃酸和缺血再灌注所致急性肾损伤(AKI)后慢性肾脏病(CKD)动物模型的差异.方法 BALB/c小鼠分为马兜铃酸损伤(AAI)组、AAI对照组、缺血再灌注损伤(IRI)组、IRI对照组,AAI组以5 mg/kg剂量腹腔内注射马兜铃酸,AAI对照组腹腔注射等量生理盐水;IRI组予37℃双侧肾动脉夹闭缺血32 min,IRI对照组予假手术;于给药或再灌注后1、3、7、14、28、42 d收集标本.观察不同时间点各组小鼠的死亡情况及体重,自动分析法检测各小鼠血清肌酐、血清尿素氮水平,肾组织PA S染色评估肾损伤程度,Masson染色评估肾脏纤维化情况.结果 IRI组死亡率显著高于AAI组(P<0.05);AAI组小鼠体重下降更显著(P<0.05);IRI和AAI组小鼠血肌酐、尿素水平均高于对照组(P<0.05);IRI组术后第1天肾损伤最重,AAI组第7天肾损伤最重,至造模后42 d部分肾小管仍无完整结构;与对照组比较,造模后14 d IRI和AAI组均开始出现纤维化,AAI组纤维化阳性面积多于IRI组(P<0.05).结论 AAI和IRI均可成功构建小鼠AKI-CKD模型,但AAI模型更简单、稳定. 相似文献
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目的观察大鼠缺血再灌注损伤肾组织Trps1的表达变化及其与肾组织病变的关系,探讨Trps1在肾脏修复再生中的作用。方法 42只雄性SD大鼠分为假手术组、缺血再灌注组。经腹正中切口分离大鼠双侧肾蒂,用无损动脉夹夹闭60 min后恢复灌注,假手术组仅暴露肾蒂不夹闭。于再灌注后1、3、7、14、21 d取大鼠动脉血及肾组织标本,采用自动生化分析仪检测大鼠血肌酐、尿素氮水平,PAS染色检测肾组织损伤情况,免疫组化和Western blot检测肾组织Tprs1表达变化。结果假手术组大鼠血肌酐和尿素氮分别为(30.12±2.95)μmol/L、(5.89±0.67)mmol/L。与假手术组相比,大鼠肾脏缺血再灌注后1、3、7 d血肌酐[(319.25±25.49)、(338.20±22.70)、(216.07±18.54)μmol/L]及尿素氮[(33.53±8.06)、(78.05±7.13)、(42.61±11.87)mmol/L]显著升高(P<0.05),14、21 d血肌酐[(33.33±6.46)、(32.06±8.74)μmol/L]及尿素氮[(6.02±1.27)、(6.93±3.28)mmol/L]与假手术组相比无显著差异(P>0.05)。PAS染色显示肾组织在再灌注1 d时即出现损伤,3 d时损伤最重,7 d时损伤开始修复,至第21天修复完全。免疫组化及Western blot显示,假手术组Trps1主要在皮质肾小管上皮细胞表达,缺血再灌注后1 d肾组织Trps1表达显著下降(P<0.05),3 d仅见微弱表达(P<0.05),7、14 d表达开始上升,但仍有显著差异(P<0.05),21 d与假手术组水平无显著差异(P>0.05)。相关性分析显示Trps1表达变化与肾小管急性损伤评分呈负相关(r=-0.81,P<0.05)。结论 Trps1在AKI肾脏损伤修复期表达上调,与肾组织损伤指标呈负相关,提示其可能具有促进肾脏修复再生的作用。 相似文献
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目的 比较传统血液透析(HD)和血液透析联合血液滤过(HF)对尿毒症患者外周血成纤维细胞生长因子23(FGF23)的清除效果.方法 维持性HD的慢性肾脏疾病(CKD)5期患者212例,随机分为HD组和HD联合HF组.HD组处方:3次/周,4 h/次;HD联合HF组处方:HD 2次/周,4 h/次,HF 1次/周,6 h/次.观察周期8周.两组患者在观察开始和观察结束时分别采静脉血进行以下指标检测:全自动生化仪检测血磷(P)、血钙(Ca)、尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)水平,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清总甲状旁腺激素(iPTH)和FGF23水平,放射免疫测定法检测血浆1,25二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3]水平.结果 观察开始时两组患者血P、血Ca、BUN、Scr、iPTH、FGF23和1,25(OH)2D3均无统计学差异(P>0.05).HD组观察结束和开始比较,血P、血Ca、iPTH、FGF23和1,25(OH)2D3均无统计学差异(P>0.05),BUN和Scr水平显著性降低(P<0.001).HD联合HF组治疗前后比较,血ca和1,25(OH)2D3无统计学差异(P>0.05);治疗后血P、iPTH、FGF23、BUN和Scr水平均显著性降低(P<0.001).治疗后,HD联合HF组与单纯HD组比较,血P、iPTH和FGF23均显著降低,差异有统计学意义(P<0.001).结论 与HD比较,HD联合HF治疗模式可显著降低终末期尿毒症患者循环血中的P、iPTH和FGF23水平,表明HD联合HF治疗模式对中、大分子物质有较好的清除效果,是较理想的组合治疗模式. 相似文献
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目的 对hNaDC1基因启动子序列转录调控元件进行初步分析.方法 构建hNaDC1基因5'侧翼序列系列缺失质粒,以双荧光素酶报告基因检测系统检测hNaDC1基因5'侧翼区(-2 232/ 136)的转录调控元件与转录调控蛋白之间的相互作用.结果 pGL3-hNaDC1A质粒的转录活性最高,为(2.98±0.45);pGL3-hNaDC1D的转录活性最低,为(0.45±0.14).以pGL3-hNaDC1A质粒的转录活性为基准(100%),其他4种质粒相应的转录活性分别为:pGL3-hNaDC1B 86.7%,pGL3-hNaDC1C 89.4%,pGL3-hNaDC1D 15.8%,pGL3-hNaDC1E 61.2%.MatInspector 5.0软件预测结果显示hNaDC1基因5'侧翼启动子序列共含有22个14种转录因子结合位点.结论 hNaDC1基因5'侧翼区-1 084/-254和-12/ 136区域可能存在有正性作用转录因子的结合位点. 相似文献