两种脑性瘫痪鼠模型的对比

背景:现阶段主要围绕宫内窘迫,围生期缺氧缺血,胆红素脑病以及生后感染因素来构建脑性瘫痪模型,脑损伤后遗症不明显,联合损伤构建模式被逐渐认识。目的:采用孕后期宫内感染及缺氧联合序贯缺氧缺血构建脑性瘫痪大鼠模型,对这些模型鼠进行评估,比较存在优势。方法:孕鼠随机分为实验1组、实验2组和对照组。实验组孕16d行腹腔脂多糖注射并缺氧2.5h,对照组行生理盐水腹腔注射,隔日1次,直至分娩,所生幼鼠与其母鼠属同一组。实验1组幼鼠生后7d行双侧颈总动脉结扎。生后14和28d分别行体质量、爬梯、mNSS评分、旷场实验和病理切片。结果与结论:实验1组动物体质量显著低于其他两组(P<0.01),爬梯掉下来的次数及MNSS评分均显著高于对照组(P<0.05,P<0.01),28d爬行距离最短,各项检测均提示生长发育迟缓,肌力肌张力不稳定,正常反射出现较迟(P<0.05),病理切片提示灰质神经元排列紊乱,白质层变薄,炎性细胞浸润。实验2组幼鼠脑损伤程度较实验1组轻,后遗症状不明显。提示孕后期脂多糖注射及缺氧合并生后双侧颈总动脉结扎可以制备大鼠脑性瘫痪模型并能稳定至生后4周。     

免疫性血小板减少症患儿骨髓间充质干细胞与其他来源的间充质干细胞免疫调节作用的比较研究

目的比较免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)患儿与正常人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)及脐带来源间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)的性质及其对正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分泌干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)的调节能力。方法用密度梯度离心法体外分离培养16例ITP患儿和8例正常成人BMMSCs至5-6代,用酶消化法从10例健康胎儿脐带组织中分离培养UC-MSCs至5-6代。在培养过程中观察三种来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)形态,进行细胞表面分子及成脂成骨分化鉴定并用细胞增殖检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测三种MSCs的增殖能力。将上述三种MSCs用丝裂霉素(mitomycin C,MMC)处理后与植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)刺激的PBMC按不同比例(1∶40,3∶40,9∶40)混合培养3 d,收集培养上清液。用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组共培养上清液中IL-10和IFN-γ的含量。结果三种MSCs有相似的细胞形态,UC-MSCs增殖速度最快,正常成人BMMSCs次之,ITP患儿BMMSCs最慢;三种MSCs有相似的分化能力。三种来源MSCs与PBMC以不同比例混合培养,随着MSCs比例的增加,PBMC分泌IL-10增加,在ITP患儿BMMSCs组中不同比例之间差异有显著性(P<0.05),而在正常人BMMSCs、UC-MSCs组中不同比例之间差异有非常显著性(P<0.01);随着MSCs比例的增加,PBMC分泌的IFN-γ减少,在ITP患儿及正常人BMMSCs组中不同比例之间差异有显著性(P<0.05),而在UC-MSCs组中不同比例之间差异有非常显著性(P<0.01)。在相同共培养比例条件下,三种MSCs刺激PBMC分泌IL-10和IFN-γ的量差异均无显著性(P>0.05)。结论 ITP患儿BMMSCs较其他两种来源的MSCs增殖速度慢,说明其体外增殖存在缺陷。但ITP患儿BMMSCs与其他两种来源MSCs对PBMC分泌IL-10、IFN-γ的调节具有相同的特点,即促进IL-10分泌,抑制IFN-γ分泌,均呈剂量依赖性,即三种细胞调节PBMC分泌IL-10及IFN-γ能力未见明显差异。     

粒细胞集落刺激因子对移植的人神经干细胞体内分化的影响

目的 观察缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠应用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对移植的人神经干细胞(hNSCs)体内分化成星形胶质细胞的影响.方法 新生1周的Wistar大鼠建立HIBD模型后分成2组:NSC移植组(A组,n ＝ 16)和NSC移植 + G-CSF治疗组(B组,n ＝ 16),其中B组建模后1 h即开始皮下注射G-CSF,1次/d,移植前后连续5 d注射G-CSF.两组均于建模后第2天经脑室移植hNSCs.移植后1、2周分别用免疫荧光法检测植入细胞在大鼠脑内向星形胶质细胞分化的情况.结果 移植后1周,B组植入细胞分化的星形胶质细胞数量较A组多,差异有统计学意义(t ＝ 4.83,P ＜ 0.01).移植后2周,两组植入细胞分化的星形胶质细胞数量上差异无统计学意义(t ＝ 1.59,P ＞ 0.05).结论 G-CSF能在移植后早期促进植入的外源性NSCs向星形胶质细胞分化.     

冷藏保存时间对人少突胶质前体细胞的影响

目的 评价冷藏保存时间对人少突胶质前体细胞生物学特性的影响。方法 取生长状态良好的第3代人少突胶质前体细胞,按照4×107 mL-1细胞浓度重悬于含有10 g/L 人血清白蛋白的50 g/L葡萄糖保存介质中,置于2～8 ℃冷链运输箱中保存24 h、48 h、72 h,与新鲜制备的少突胶质前体细胞（即冷藏保存0 h细胞）比较,评价冷藏保存时间对细胞活率、增殖能力、迁移能力、免疫表型及分化能力的影响。将冷藏保存24 h的少突胶质前体细胞移植到脑白质损伤大鼠侧脑室内,观察移植细胞在体内成髓鞘情况。结果 与冷藏保存0 h细胞比较,冷藏保存24 h、48 h细胞活率没有显著差异,冷藏保存72 h细胞活率明显下降（P<0.05）;通过CCK8法检测各组细胞增殖能力,结果显示冷藏保存24 h和48 h细胞增殖能力与冷藏保存0 h的细胞比较无显著差异,冷藏保存72 h细胞增殖能力显著下降（P<0.05）;细胞体外迁移和分化结果显示,与冷藏保存0 h细胞比较,冷藏保存24 h的细胞迁移和分化能力无显著差异,冷藏保存48 h和72 h,细胞迁移和分化能力显著下降。体内实验证实,冷藏保存24 h的少突胶质前体细胞在体内可以分化为产髓鞘碱性蛋白的少突胶质细胞。结论 人少突胶质前体细胞在含有10 g/L人血白蛋白的50 g/L葡萄糖保存介质中冷藏保存24 h,细胞活率、迁移和分化能力较好,因此,建议少突胶质前体细胞制剂冷藏保存24 h内移植,以确保最佳治疗效果。     

适于人源少突胶质前体细胞长期体外扩增的较经济的培养方法

目的 细胞替代治疗是髓鞘化障碍疾病的可能有效的治疗方法.而细胞替代治疗必须具有相应的体外培养少突胶质前体细胞的方法.因此,本研究为了提供临床治疗所需的细胞,发展出了一种简单、经济且高效的获得人源少突胶质前体细胞(OPCs)的方法,为临床治疗提供了新的方法.方法 通过磁珠分选的方法得到人源OPCs,将其接种到OPCs增殖培养基中,观察短期(2、4、6、8d)和长期体外培养中OPCs的形态,免疫荧光染色鉴定第4代细胞OPCs特异标志O4、转录因子Sox10和血小板源性生长因子α受体(PDGFαR)的表达情况及诱导后分化为少突细胞的能力,同时观察B27和N1对OPCs生长状态的影响.结果 短期培养时,OPCs具有典型的双极或是三极形态且增殖状况良好.经过4代的长期培养,4代细胞均具有典型双极或三极形态;第4代OPCs免疫荧光染色鉴定90％以上细胞表达OPCs特异标志O4、Sox10和PDGFαR,诱导后,可以分化为少突胶质细胞.可见经过4代的长期培养,OPCs仍保持着初始性状且具有分化为少突细胞的能力并且仍然保持着较高纯度,表明该培养基适合人源OPCs长期培养.结论 使用该培养方法,分离得到的人源OPCs在体外不仅能够稳定培养和扩增,还具有分化为少突细胞的能力.通过这种可重复的方法,可以在体外尽可能简单的稳定获得大量高纯度人源OPCs,为临床应用提供了新的选择.且该方法使用较少的细胞因子,因此为髓鞘化障碍或髓鞘损伤疾病将来的细胞治疗,提供了一种适用于临床的OPCs的稳定高效的较经济的培养方法.     

胚胎干细胞专利相关信息分析

目的对1985年至2004年12月的胚胎干细胞相关专利信息进行详细阅渎和分析,了解国内、外胚胎干细胞相关专利的情况。方法以干细胞及胚胎干细胞为主题词,以德文特(Der- went)数据库为背景,对多个专利数据库进行检索、筛查和分类,建立胚胎干细胞专利数据库。从专利的角度入手,对数据库中的630篇国际及44篇国内胚胎干细胞专利文献进行分类分析。结果胚胎干细胞研究领域的专利申请情况总体呈上升趋势;申请范围主要涉及动物细胞或组织、修饰的细胞、脊椎动物新品种及未分化的人类/动物细胞等方面,国际(13.4%)和国内(20.9%)申请均以涉及动物细胞或组织的占据首位;国内申请中涉及未分化的人/动物细胞的专利较多(19.8%);转基因动物、细胞建系及核移植技术相关的专利申请是胚胎干细胞相关专利中的重要组成部分。结论国内外胚胎干细胞相关信息的分析表明,目前我国在胚胎干细胞研究申请专利方面相对比较宽松,我们应该在涉及胚胎干细胞的分离、建系、在基因工程及细胞组织工程学方面的用途和方法以及胚胎干细胞在药物筛选过程中的用途等方面集中投入力量,争取有新的突破。     

少突胶质前体细胞移植治疗早产儿脑白质损伤大鼠模型

目的探讨少突胶质前体细胞(OPCs)移植对治疗早产儿脑白质损伤(WMI)模型大鼠的长期作用。方法将80只3日龄Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、模型对照组、5 d脑室/白质移植组、9 d脑室/白质移植组、14 d脑室/白质移植组(n=10);除假手术组外其余各组行右侧颈总动脉离断并缺氧80 min制备早产儿WMI模型;采用孕10~12周人胚胎脑组织制备OPCs。各移植组分别在造模后5 d、9 d和14 d将3×105OPCs注入右侧脑室/脑白质中,待大鼠60日龄和90日龄时分别对各组行电镜下脑髓鞘评估和神经功能评估。结果电镜下,大鼠60日龄时各移植组髓鞘损害程度相比模型组略有改善;无论是与同组60日龄大鼠还是与同日龄模型组大鼠比较,90日龄时各移植组的髓鞘均明显增厚,结构破坏更少,其中14 d移植组变化最为明显;但不同移植时间脑室和白质移植组间的髓鞘损害程度未见有明显差异。60及90日龄各移植组大鼠的神经功能缺陷评分(m NSS)均高于假手术组,但均低于模型组(P0.05)。结论 OPCs移植可能对治疗早产儿WMI存在长期效应,延迟移植时间可能增强疗效。     

高压氧对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠人神经干细胞移植后神经细胞凋亡的影响

新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是指围产期缺氧、脑血流减少或暂停导致的胎儿或新生儿脑损伤.近年来虽然产科技术有了较大的发展,但新生儿HIE的发病率并未明显减少,Itoo等[1]报道活产足月新生儿HIE的发病率为5.5‰,HIE仍然是导致新生儿死亡和神经系统后遗症的主要原因之一.Long等[2]报道,新生儿重度HIE病死率高达50%,存活者常伴有严重后遗症.本文模拟缺氧缺血性脑损伤(HIBD)制作实验动物模型,高压氧治疗后行人神经干细胞移植手术,观察高压氧对人神经干细胞移植后神经细胞凋亡的影响.大鼠是最常用来研究HIBD的实验动物,7日龄大鼠脑细胞分裂增殖、皮质细胞组成、神经突触数量、神经点生理指标等与32～34周胎龄人脑类似[3].本实验中采用经典的Rice法[4]制作HIBD新生大鼠模型.     

含人LINGO-1慢病毒干扰载体的构建与鉴定

目的 体外构建含人LINGO-1慢病毒干扰载体,并测定其对靶基因LINGO-1的干扰效应。方法 2015年3-11月,根据GenBank数据库中报道的人LINGO-1基因序列,设计合成针对人LINGO-1短发夹RNA（LINGO-1 shRNA）干扰序列,并将其克隆至重组质粒载体,测序验证后在293T细胞内包装慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒载体分为目标基因干扰载体组（实验组）和错配序列干扰载体组（对照组）,并转染至人胶质细胞瘤细胞U251,荧光显微镜下观察其感染效率,并采用免疫荧光染色、实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）法检测LINGO-1 mRNA表达水平,采用Western blotting法检测LINGO-1表达水平。结果 成功构建两组慢病毒干扰载体,经过包装分别得到滴度为2×108 TU/ml和4×108 TU/ml的病毒原液。病毒载体感染人胶质细胞瘤细胞U251后,实验组和对照组载体转染效率分别为96.6%、95.2%。免疫荧光染色显示,人胶质细胞瘤细胞U251高表达LINGO-1,经慢病毒载体转染后,实验组免疫荧光呈现减弱现象。实验组LINGO-1 mRNA表达水平（0.09±0.01）较对照组的（1.00±0.00）降低（t=12.87,P＜0.01）,实验组LINGO-1 mRNA相对表达抑制率为91.0%。实验组LINGO-1表达水平（0.28±0.02）较对照组的（1.00±0.00）降低（t=-8.13,P＜0.01）。结论 本研究成功构建了含人LINGO-1 shRNA干扰载体,并证实了干扰载体对靶基因有较好的干扰效果,为研究LINGO-1在轴突再生中的作用奠定了基础。