负载TGF-β1微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的研制负载转化生长因子β1（transforming growth factor—β1,TGF—B。）壳聚糖微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）体外构建组织工程软骨,观察将其移植修复兔膝关节软骨缺损的效果。方法通过密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化MSCs,以抗兔CD14、CD44等单抗采用流式细胞仪进行MSCs表面抗原鉴定,获得纯化的MSCs。采用乳化交联法获得包裹TGF—B,壳聚糖缓释微球,并将该微球负载在冷冻干燥获得的壳聚糖一丝素支架上。将培养的MSCs种植到支架上,体外构建组织工程软骨,移植到兔关节软骨缺损处。移植空白支架的为实验对照组,移植体外构建的组织工程软骨为实验组。主要观察指标,流式检测的MSCs细胞表面标记情况,微球的形态,支架与细胞共培养后电镜下情况,支架移植后的兔关节修复情况及组织学检查。结果流式检测MSCs第4代及第9代细胞的CD14及CD44表面抗原的表达情况发现两代MSCsCD14表达基本呈阴性,CD44表达呈阳性,符合间充质干细胞的特性。扫描电镜观察所制备的微球基本呈球形,表面光滑,直径约为1μm,大小较均一,分散度好。细胞在壳聚糖-丝素三维支架上生长状态良好,电镜观察,可见支架孔隙内有细胞黏附生长。移植治疗后发现实验组修复明显好于对照组,实验组术后3个月实验组已经有较硬的类软骨组织填充修复,切片显示有软骨细胞规则排列,甲苯胺蓝染色为阳性,而对照组仅为纤维组织修复,切片显示为纤维组织或纤维软骨组织修复,软骨细胞排列紊乱,甲苯胺蓝染色阴性或弱阳性。结论负载TGF—β1壳聚糖微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞体外复合培养后移植治疗修复兔膝关节软骨缺损,具有较好的疗效。     

乐果单克隆抗体制备的初步研究

目的:制备特异性抗乐果单克隆抗体(McAb)。方法:采用生产乐果的中间体硫磷酯与1,4-二氨基丁烷反应合成乐果半抗原,利用碳二亚胺法,将半抗原与牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联,分别制备免疫原和包被原。将免疫的BALB/c小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合,通过杂交瘤技术,制备特异分泌抗乐果McAb的杂交瘤细胞,并通过有限稀释法克隆化3次。用间接ELISA检测该McAb的效价和亲和性,用间接竞争ELISA检测与其他结构类似物的交叉反应率。结果:通过偶联,获得免疫原和包被原,半抗原与BSA和OVA的偶联比分别为13:1和11:1。通过杂交瘤技术,获得1株特异分泌抗乐果McAb的杂交瘤细胞,其培养上清与腹水效价分别为1:32和1:1024,McAb亲和常数为1.4×104L/mol,与氧化乐果的交叉反应率为10.6%,与其他所测结构类似的农药交叉反应率均小于0.5%。结论:通过杂交瘤技术,获得1株特异分泌抗乐果McAb的杂交瘤细胞,但McAb效价、亲和力都较低,与制备试剂盒的要求尚有较大的差距。     

骨髓间充质干细胞联合血管内皮生长因子移植治疗糖尿病兔下肢缺血的实验研究

目的 用包裹血管内皮生长因子(VEGF)的纳米球与骨髓间充质干细胞(BMSCs)共同多点肌内注射到糖尿病兔下肢缺血部位,以期使糖尿病兔下肢缺血症状改善,缺血部位形成新的血管。方法 通过密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化BMSCs。采用超声乳化-溶剂挥发法制备包载VEGF的PLGA纳米球,并检测其各指标。按100mg/kg耳缘静脉注射四氧嘧啶制备糖尿病兔模型,14天后空腹血糖>16mmol/L确定为糖尿病模型。成模的糖尿病兔双侧下肢股动脉结扎制作下肢缺血模型,并分4组在股动脉结扎离断区进行多点注射治疗。PBS组、BMSCs组、VEGF组和BMSCs+VEGF组,同时设正常对照组。主要观察指标:治疗后各组兔子活动情况、大体解剖情况及下肢缺血区血管形成情况。结果 制备的PLGA纳米粒基本呈球形,分散较好,平均粒径为438.97±15.60nm。载VEGF的PLGA纳米粒包封率为87.4%,载药量为43.7μg/g。24h释放率55.48%。共选用28只雌兔制作糖尿病模型,死亡14只,成模12只,2只血糖没达到糖尿病模型标准。死亡率为50%,模型成功率为42.86%,不敏感率7.14%。移植后1个月发现注射PBS组的1只兔子胫骨有一1.0cm×1.5cm的溃疡,行走时呈拖行,另2只呈跛行。注射VEGF组3只兔子均呈跛行。注射MSC组有2只跛行,1只行走正常。注射BMSCs+VEGF组2只行走正常,活动自如,仅1只略呈跛行。从大体解剖结果及切片结果都可以看出移植BMSCs组、VEGF组及BMSCs+VEGF组在结扎股动脉后,可形成侧支循环,使股动脉远端保持充盈,血供良好,尤其是移植BMSCs+VEGF组形成的侧支较多。而PBS治疗组股动脉远端未见充盈,只有回流的股静脉增粗。结论 用包裹VEGF的PLGA纳米球与BMSCs共同多点肌内注射到糖尿病兔下肢缺血部位,对糖尿病兔下肢缺血区血管有促进生成作用,能改善动物模型下肢缺血的症状。     

甲胎蛋白单克隆抗体酶联免疫诊断试剂盒的研制及应用

目的 为研制一种特异性强、灵敏度高、操作简便快速的甲胎蛋白（AFP）单克隆抗体酶联免疫诊断试剂盒，用于定量检测血清中的AFP。方法 将自行研制的AFP单克隆抗体（AFP-McAb）标记辣根过氧化物酶，AFP多抗（AFP-PcAb）包被微孔反应板，研制成AFP单克隆抗体酶联免疫诊断试剂盒。血清中的AFP与包被于微孔板上的AFP多抗结合，再与AFP酶标抗体结合，在TMB底物液作用下形成肉眼可见的蓝色。结果 该诊断试剂盒对305份临床病人血清进行了检测，结果与放射免疫法相比总符合率为98．6％；对215份临床病人血清进行检测，结果与化学发光法相比总符合率为99．0％；灵敏度达10ng／ml。结论 该试剂盒检测AFP特异性强、灵敏度高、操作简便、结果准确，具有临床推广应用价值。     

载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒的制备及体内体外评价

 目的 本实验拟制备载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒(NH₂-MSN-RES),以期提高白藜芦醇(Res)的生物利用度。方法 采用改良的Stober法合成氨基修饰介孔二氧化硅(NH₂-MSN),发明了反复饱和溶液吸附法载入白藜芦醇制备载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒,透析袋法考察其体外释药特性,MTT法考察载体对Caco-2的细胞毒性,研究载体对白藜芦醇的跨膜转运能力和在大鼠体内的药动学特性。结果 氨基修饰介孔二氧化硅氨基成功修饰,呈圆整球形,分布均一,对Caco-2细胞无明显的毒性。反复饱和溶液吸附法吸附8次,载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒的载药量为(19.26±2.51)%,体外释药呈现明显的缓控释特性,载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒对Caco-2细胞单层模型具有良好的跨膜转运能力。药动学参数表明,载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒的AUC_0-t是白藜芦醇溶液的2.58倍,并且t_1/2、t_max和ρ_max显著提高,同时载体使白藜芦醇由单室模型变为二室模型。结论 改良的Stober法成功合成氨基修饰介孔二氧化硅,反复饱和溶液吸附法能够有效提高载药量,载白藜芦醇的氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒提高了白藜芦醇的生物利用度,氨基修饰介孔二氧化硅是一种有前景的口服给药纳米材料。     

几种胚胎干细胞标志在牙周膜细胞中的表达及意义

目的检测部分胚胎干细胞标志在牙周膜细胞中的表达。方法通过酶解组织块法分离牙周膜细胞,利用多向分化实验和流式细胞术分析表面标志对获得细胞进行鉴定。利用免疫荧光法和RT-PCR法检测牙周膜细胞中Oct4、Nanog、Sox2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81这些胚胎干细胞标志的表达。结果牙周膜细胞为成纤维细胞样,可分化为成骨细胞和成软骨细胞,可均一表达间充质细胞标志CD44、CD90、CD105,异质性表达间充质标志CD146、Stro-1。细胞免疫荧光实验显示牙周膜细胞表达部分胚胎干细胞标志:Oct4、Nanog、SSEA-4、TRA-1-60阳性,Sox2、TRA-1-81阴性。半定量RTPCR结果显示P3和P8代牙周膜细胞表达Oct4和Nanog,表达量差异不大,Sox2则为阴性。结论牙周膜细胞除了表达常用间充质干细胞标志外,也可表达部分胚胎干细胞标志,这对牙周膜细胞的鉴定和进一步分选纯化有一定应用价值。     

幽门螺杆菌感染的免疫防治研究进展

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)属革兰阴性菌，它是全世界最普遍感染人类的细菌之一，感染后不予治疗将导致长期甚至终生在胃内定植，并能引起许多相关的疾病，如：慢性胃炎、消化性溃疡、胃腺癌、胃B细胞淋巴瘤等。目前的抗Hp治疗包括抗分泌加抗生素，     

负载TGF-β1微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的研制负载转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)壳聚糖微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外构建组织工程软骨,观察将其移植修复兔膝关节软骨缺损的效果。方法通过密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化MSCs,以抗兔CD14、CD44等单抗采用流式细胞仪进行MSCs表面抗原鉴定,获得纯化的MSCs。采用乳化交联法获得包裹TGF-β1壳聚糖缓释微球,并将该微球负载在冷冻干燥获得的壳聚糖-丝素支架上。将培养的MSCs种植到支架上,体外构建组织工程软骨,移植到兔关节软骨缺损处。移植空白支架的为实验对照组,移植体外构建的组织工程软骨为实验组。主要观察指标,流式检测的MSCs细胞表面标记情况,微球的形态,支架与细胞共培养后电镜下情况,支架移植后的兔关节修复情况及组织学检查。结果流式检测MSCs第4代及第9代细胞的CD14及CD44表面抗原的表达情况发现两代MSCs CD14表达基本呈阴性,CD44表达呈阳性,符合间充质干细胞的特性。扫描电镜观察所制备的微球基本呈球形,表面光滑,直径约为1μm,大小较均一,分散度好。细胞在壳聚糖-丝素三维支架上生长状态良好,电镜观察,可见支架孔隙内有细胞黏附生长。移植治疗后发现实验组修复明显好于对照组,实验组术后3个月实验组已经有较硬的类软骨组织填充修复,切片显示有软骨细胞规则排列,甲苯胺蓝染色为阳性,而对照组仅为纤维组织修复,切片显示为纤维组织或纤维软骨组织修复,软骨细胞排列紊乱,甲苯胺蓝染色阴性或弱阳性。结论负载TGF-β1壳聚糖微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞体外复合培养后移植治疗修复兔膝关节软骨缺损,具有较好的疗效。