STAT5基因对人膀胱癌细胞顺铂化疗敏感性的影响及作用机制

目的研究STAT5基因高表达及沉默对人膀胱癌细胞系5637和T24顺铂化疗敏感性的影响及分子机制。方法冲击诱导方法构建顺铂耐药细胞株T24-cisplatin和5637-cisplatin,Western bolt法检测STAT5的表达;构建STAT5过表达载体,应用脂质体转染5637和5637-cisplatin细胞,用针对STAT5基因的特异性sh RNA转染T24和T24-cisplatin细胞,MTT法和流式细胞凋亡法检测转染前后膀胱癌细胞顺铂化疗的细胞生存率和凋亡率,及Western blot法检测细胞凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Caspase-3表达。结果顺铂耐药细胞株5637-cisplatin和T24-cisplatin STAT5表达明显高于顺铂敏感株5637和T24(P=0.004;P=0.001),而5637-cisplatin和T24-cisplatin细胞沉默STAT5其化疗敏感性显著升高(P=0.003,P=0.001)。5637细胞过表达STAT5其化疗敏感性显著下降(P=0.021),顺铂化疗的细胞凋亡率明显下降(P=0.002),Bax、Caspase-3表达水平显著降低(P=0.014;P=0.033),Bcl-2表达水平显著升高(P=0.001)。T24细胞STAT5被沉默后其化疗敏感性显著增强(P=0.011),顺铂化疗的细胞凋亡率明显上升(P=0.001),Bax、Caspase-3表达水平显著升高(P=0.001;P=0.007),Bcl-2表达水平显著降低(P=0.020)。结论STAT5表达情况与膀胱癌细胞顺铂化疗敏感性具有相关性,其可能分子机制为调控凋亡基因Bax、Bcl-2、Caspase-3介导细胞顺铂耐药。     

肿瘤抗原负载DC激活的CTL对裸鼠移植瘤作用的研究

目的研究负载人喉癌细胞系Hep一2冻融抗原的树突状细胞（DC）体外活化的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在裸鼠Hep一2移植瘤发生、发展中的作用。方法以健康人外周血贴壁单核细胞体外诱导DC并负载Hep一2冻融抗原,经MTT法检测其激活的同基因型T淋巴细胞在体外对Hep-2的杀伤活性后,将此Hep一2特异性CTL预防性接种于裸鼠皮下（预防组6只,对照组16只）,3天后接种Hep-2,观察其移植瘤的发生率：再将此CTL分以1次、2次治疗性接种于已荷瘤裸鼠皮下（对照组6只;治疗组和加强治疗组各5只）,观察移植瘤的生长情况。结果预防组Hep一2移植瘤的发生率明显低于对照组（预防组33％,对照组00％,P=0．0002）;治疗组与加强治疗组裸鼠荷瘤体积明显小于对照组（P〈0．05,P〈0．01）,且加强治疗组裸鼠荷瘤体积明显小于治疗组（P〈0．05）。结论负载Hep一2冻融抗原的DC活化的CTL不仅能预防裸鼠Hep一2移植瘤发生而且能抑制其移植瘤的生长。     

Beclin-1在肾癌组织中的表达及其临床意义

目的研究Beclin-1在肾癌中的表达及其临床意义。方法通过免疫组化检测肾癌中自噬相关基因Beclin-1的表达情况,初步探讨Beclin-1在肾癌组织中表达情况。并分析Beclin-1表达与肾癌复发及生存时间的相关性;多因素分析探讨其是否为肾癌预后的独立危险因素。结果对133例肾癌及12癌旁组织进行检测,肾癌组织中Beclin-1基因表达水平明显低于癌旁组织(P<0.05)。Beclin-1基因阴性肾癌患者的复发率明显高于Beclin-1基因阳性患者(P=0.041);Beclin-1阳性肾癌患者总体生存率明显高于Beclin-1阴性肾癌患者(P=0.008)。多因素分析显示,Beclin-1,肿瘤分级、分期及淋巴结转移与否是肾癌复发、死亡的独立预后因素。结论 Beclin-1低表达是肾癌预后不良的独立危险因素,它可能成为肾癌个体化治疗的潜在靶点。     

沉默CRAF基因表达对肝癌细胞侵袭和迁移的影响

目的：探讨肝癌细胞中原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（CRAF）高表达对肝细胞癌（HCC）侵袭和转移的影响,并阐明其机制。方法：以CRAF高表达的SMMC-7721细胞作为研究对象,采用shRNA技术下调CRAF表达。将SMMC7721细胞分为对照组和沉默组（shCRAF#1转染组和shCRAF#2转染组）。细胞划痕法观察各组SMMC7721细胞创口愈合指数,Transwell实验检测各组SMMC-7721细胞的穿膜细胞数,Western blotting法检测各组SMMC7721细胞中基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达水平。结果：细胞划痕实验,与对照组比较,沉默组SMMC7721细胞的创口愈合指数明显降低（P<0.05）。Transwell实验,与对照组比较,沉默组SMMC7721细胞的穿膜细胞数降低（P<0.05）。Western blotting法检测,沉默组细胞中MMP-2和MMP-9表达水平明显低于对照组（P<0.05）。结论：下调CRAF可以通过抑制MMP-2和MMP-9表达抑制肝癌SMMC7721细胞的侵袭和迁移。     

低强度脉冲超声对不同钛表面骨髓间充干细胞成骨分化的影响

目的:观察低强度脉冲超声(LIPUS)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在钛片表面成骨分化的影响.方法:将体外培养的BMSCs分别接种于光滑钛表面和大颗粒喷砂酸蚀(SLA)钛表面,进行矿化诱导并实施超声干预和假刺激.于矿化诱导后3、7d进行碱性磷酸酶(ALP)定量检测,14 d进行ALP染色观察;矿化诱导21 d后行茜素红染色;于矿化诱导14、21 d检测成骨相关基因及蛋白表达.结果:矿化诱导后3、7d超声组ALP活性较对照组高(P＜0.05),14 d超声组与对照组相比钛片表面ALP染色明显深染;茜素红染色显示,21 d后超声组的染色更明显且形成更多的矿化结节;超声组的成骨相关蛋白成骨转录因子2、骨形成蛋白、骨桥蛋白表达增高;RT-PCR检测到成骨相关基因、ALP、成骨转录因子2、骨形成蛋白、骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白均有不同程度表达增高(P＜0.05).结论:LIPUS可以促进光滑及SLA钛表面BMSCs的成骨分化.     

HSV-TK单基因及其与hIL-12融合基因表达载体的构建

目的构建HSV-TK单基因和TK/hIL12融合基因的真核表达载体。方法 PCR扩增质粒pGT60-hIL12中HSV-TK与hIL12治疗基因片段,同时引入pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点,构建HSV-TK单基因及其与hIL12融合基因的真核表达载体。结果 DNA测序分析、限制性双酶切鉴定证实构建的真核表达载体中治疗基因的序列、大小和方向正确。结论成功构建了pcDNA3.1-TK和pcDNA3.1-TK/hIL12真核表达载体,为进一步探索HSV-TK与hIL12基因的协同抗瘤作用提供实验基础。     

EZH2抑制剂GSK126对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨zeste基因增强子同源物2（EZH2）特异性抑制剂GSK2816126（GSK126）对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响,阐明其可能机制。方法：常规体外培养A549细胞,将细胞分为对照组和不同浓度（1.0、2.5、5.0、10.0和15.0μmol·L^-1） GSK126组。MTT比色法检测各组细胞存活率,克隆形成实验检测各组细胞集落形成数并计算克隆形成率,EdU细胞增殖成像法检测各组细胞增殖率,Hoechst-33342荧光染色法观察各组细胞凋亡形态表现,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、B细胞淋巴瘤-2原癌基因（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和活化型天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved-Caspase-3）蛋白表达水平。结果：MTT比色法,与对照组比较,随着GSK126浓度升高,不同浓度GSK126组细胞存活率明显降低（P<0.05）;克隆形成实验,与对照组比较,随着GSK126浓度升高,不同浓度GSK126组克隆形成率逐渐降低（P<0.05）;EdU成像,与对照组比较,随着GSK126浓度升高,不同浓度GSK126组增殖率明显降低（P<0.01）;Hoechst-33342染色,与对照组比较,随着GSK126浓度的升高,5、10和15μmol·L^-1GSK126组凋亡细胞数明显增加;流式细胞术检测,与对照组比较,随着GSK126浓度升高,不同浓度GSK126组细胞凋亡率明显升高（P<0.01）。Western blotting法,与对照组比较,随着GSK126浓度升高,不同浓度GSK126组细胞中p-AKT和Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低（P<0.05）,Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平逐渐升高（P<0.05）。结论：GSK126可能通过降低AKT磷酸化水平抑制细胞增殖,并且通过诱导Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路活化,激活凋亡途径,促进肺癌细胞凋亡。     

喉癌总RNA转染的树突状细胞诱导抗肿瘤免疫的实验研究

目的:探讨转染喉癌总RNA的树突状细胞(DCs)诱导抗喉癌反应的免疫效应.方法:用喉癌细胞总RNA转染从健康人外周血诱导的DCs以制备DCs疫苗,MTT法检测其激活的细胞毒T淋巴细胞(CTLs)在体外对喉癌的特异性杀伤作用.将此特异性CTLs预防性接种于裸鼠皮下,7 d后接种喉癌细胞,观察其移植瘤的发生率;再将此CTLs治疗性接种于已荷瘤裸鼠皮下(治疗组1次,加强治疗组2次),观察移植瘤的生长情况.结果:喉癌细胞总RNA转染的DCs能在体外激活CTLs,该CTLs能在体外诱导针对喉癌细胞的肿瘤特异性免疫杀伤及抑制作用.在CTLs预防性接种裸鼠后,其移植瘤的发生率明显低于对照组(预防组为33%,对照组为100%,P＜0.01);当给荷瘤鼠皮下注射CTLs后,治疗组与加强治疗组移植瘤体积明显小于对照组(P＜0.05或P＜0.01),且加强治疗组移植瘤体积明显小于治疗组(P＜0.05).结论:转染喉癌总RNA的DCs能在体外活化CTLs,此CTLs不仅在体外能诱导特异性抗喉癌免疫反应,而且能在裸鼠体内抑制移植瘤的发生与生长.