NOSTRIN在无精子症患者睾丸组织中的表达

目的:通过测定无精子症患者睾丸组织中内皮型一氧化氮合酶运输介导物(NOSTRIN)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达,探讨其与无精子症发病的相关性。方法:采用免疫组化法检测17例特发性无精子症患者(病例组)和10例正常男性(正常组)睾丸组织中NOSTRIN的定位和定量表达;RT-PCR检测睾丸组织中NOSTRINmRNA的表达;分光光度法测定睾丸组织中eNOS的活性;应用硝酸还原酶法测定睾丸组织上清液中NO代谢产物亚硝酸基/亚硝基(NO2-/NO3-)水平。结果:NOSTRIN在睾丸组织中表达于生精细胞、支持细胞以及血管内皮细胞,NOSTRIN在特发性无精子症患者睾丸中的表达水平显著低于正常男性;病例组患者睾丸组织中NOSTRINmRNA呈弱表达(0.312±0.076),明显低于正常组(0.793±0.082,P<0.01);病例组患者睾丸组织eNOS活性[(33.727±3.58)U/mg]与正常组[(17.69±3.84)U/mg]比较显著增高(P<0.01);病例组患者睾丸中NO2-/NO3-水平为[(48.56±8.49)μmol/L],与正常组[(25.37±9.61)μmol/L]比较显著升高(P<0.01);病例组睾丸组织中NOSTRIN表达水平与eNOS活性呈负相关(r=-0.57,P<0.01),与NO代谢产物NO2-/NO3-同样呈负相关(r=-0.61,P<0.01)。结论:无精子症患者睾丸组织中NOSTRIN表达水平降低,eNOS活性增强,NO-/NO-水平升高,这可能与无精子症的发生有着相关性。     

1166例成年男性肥胖与血清睾酮水平的关系

目的 探讨社区成年男性肥胖与血清睾酮水平的关系.方法 以社区为单位分层整群抽取遵义市20岁及以上男性居民共1 166例行问卷调查和体格检查,空腹抽取肘静脉血检测血清总睾酮(TT)、性激素结合球蛋白(SHBG)和黄体生成素(LH),计算游离睾酮(cFT)、游离睾酮指数(FTI)和睾酮分泌指数(TSI).结果 1 166例成年男性血清TT、SHBG、eFT、FTI、TSI、LH水平分别为(16.83±4.90) nmol/L、(42.15±20.21) nmol/L、(0.31±0.10) nmol/L、0.46=±0.19、3.40±2.04、(6.77±5.14)IU/L.Pearson相关分析显示腰围身高比(WHtR)、体质量指数(BMI)、腰围(WC)分别与TT、SHBG、TSI和LH呈负相关,与FTI呈正相关;WHtR与cFT呈负相关,BMI和WC与LH呈负相关,差异均有统计学意义(P＜0.05).多元线性回归分析显示WHtR与TT、SHBG、TSI、LH均呈负相关;与FTI呈正相关,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 成年男性向心性肥胖可能与血清TT、SHBG、TSI、LH下降及FTI上升有关.     

无精和严重少精子症患者Y染色体的微缺失

目的 检测我国无精和严重少精子症患者Y染色体微缺失的发生情况和位点,及其与睾丸病理学类型的关系.方法 取584例无精子症和80例严重少精子症患者精液中细胞或外周血白细胞,裂解提取DNA,用4组多重聚合酶链反应检测分布于AZFa、AZFb、AZFc区,包括欧洲男科学会和欧洲分子遗传学质量控制体系推荐的6个位点在内的共15个序列标签位点(sequence tagged site,SIS)的缺失.对部分有Y染色体微缺失患者进行睾丸细针抽吸活检,检查睾丸病理学类型.结果 584例无精子症患者中,共有66例(11.3%)发生Y染色体微缺失,各区发生率构成比由高到低依次为:AZFc区48例(72.7%),AZFb+c区9例(13.6%),AZFa+b+c区4例(6.1%),AZFb区3例(4.5%),A2Fa区2例(3.0%).80例严重少精子症患者共有10例发生Y染色体微缺失(12.5%),均为AZFc区缺失.AZFc区缺失患者(19例)睾丸病理学类型多样化;AZFb+c区或AZFa+b+c区缺失患者(7例)睾丸病理学类型为唯支持细胞综合征或生精阻滞于精原细胞.结论 Y染色体微缺失在我国的发生情况与其他国家大多数报道基本一致,跨区大缺失对精子发生造成严重影响.     

睾丸特异性小RNA：piRNA

真核细胞能产生一类长度19～30个核苷酸（nt）的小RNA，这些小RNA能在降解mRNA及翻译抑制等方面起靶向作用。与之相关的Argonaut家族蛋白分为2个亚家族：AGO亚家族，包括AGO1～44个成员，表达分布广泛，主要与miRNAs和siRNAs结合、通过与RNA干扰类似的途径抑制目的基因表达；另一个是PIWI亚家族，包括PIWI、Aubgine（AUB）和AG03，均局限表达于睾丸组织。最近4个研究小组在哺乳动物的睾丸内发现了一类新的小RNA，因能与PIWI亚家族蛋白结合，故命名为piwi—interfering RNAs（piRNAs），可能在精子发生的基因表达调控中起重要作用。     

人精子RNA的提取及含量分析

目的建立可靠的提取人精子RNA的方法,分析其含量并用于检测基因mRNA。方法9例正常精液标本液化后,经Percoll纯化,用体细胞裂解液(含0.1%十二烷基硫酸钠和0.5%Triton X-100的水溶液)于0℃处理15 min去除精子以外的细胞。用RNeasy Kit提取精子RNA,微量核酸测定仪测定RNA量。RNA用于逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),检测β-Actin、精子特异性阳离子通道2(CatSper2)、鱼精蛋白2(Protamine-2)mRNA,同时,检测c-Kit、CD4、上皮细胞钙粘蛋白(E-Cad-herin)mRNA,分别排除生精细胞、白细胞和上皮细胞的污染。结果体细胞裂解液于0℃处理15 min能去除精子以外的细胞,使精子RNA提取量提高(2.2~4.9倍)。9例正常精液标本RNA量为(233.5±75.3)ng/106精子。所有标本RNA用RT-PCR,均成功扩增β-Actin、CatSper2、Protamine-2,但扩增c-Kit、CD4、E-Cadherin未见目的条带。结论人精子中含微量RNA,本提取方法能提取人精子中微量RNA,且避免其他细胞污染,可供人精子RNA研究和临床检测选用。     

真核表达CatSper1用于筛选有效siRNA的体外实验研究

目的 构建pEGFP-N1-CatSper1重组质粒,在真核细胞中表达CatSper1,利用化学合成siRNA抑制小鼠CatSper1基因的表达,并筛选抑制效果最佳的siRNA序列. 方法 利用重组PCR克隆小鼠CatSper1全长cDNA,构建到真核表达载体中.生物信息分析软件校正结果,获得三条针对雄性小鼠CatSper1的siRNA序列,合成后分别与重组质粒pEGFP-N1-CatSper1共转染到小鼠成神经瘤N2a细胞株中,通过观察EGFP荧光强度、实时定量聚合酶链反应和WesternBlot等方法,分析干扰效果,筛选能显著降低N2a细胞中外源性CatSper1表达量的siRNA序列. 结果 成功克隆小鼠CatSper1基因的全长cDNA片段（2,061 bp）,并构建到pEGFP-N1表达载体中.三个siRNA干扰组的CatSper1 mRNA和蛋白表达与空白对照组相比均下降,其中以靠近3＇端的siRNA干扰作用更为明显,阴性对照siRNA组未引起CatSper1 mRNA和CatSper1蛋白表达明显变化. 结论 在小鼠神经瘤N2a细胞株中成功表达外源性CatSper1蛋白,并筛选出有效的siRNA,为深入研究CatSper1功能及用于避孕提供参考.     

改良的人脐带间充质干细胞培养方法

目的:建立人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离和培养方法,探讨hUCMSCs的成脂成骨分化潜能。方法:用酶消化法、传统组织块法和改良组织块法从人脐带中分离间充质干细胞,流式细胞仪检测其免疫表型;用不同的培养体系诱导hUCMSCs向成骨细胞及成脂细胞分化,并对其进行鉴定。结果:改良的hUCMSCs培养方法培养细胞纯度更高,在相同的培养时间内,改良组织块法所获得的细胞数量是酶消化法的2～3倍,是传统组织块法的20～30倍,细胞呈长梭形生长;高表达CD73、CD90、CD44、CD105,不表达CD31、CD45、CD34;茜素红染色及油红O染色证实了hUCMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论:建立了hUCMSCs的培养新方法,证实了hUCMSCs的增殖能力和多向分化潜能,为其治疗应用提供支持。     

CatSperl在小鼠睾丸发育过程中的动态表达及与人精子活力的关系

目的 研究CatSper1 mRNA在小鼠睾丸发育过程中的动态变化，并探讨CatSper1蛋白表达与精子运动的关系。方法 采用荧光实时逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）相对定量法检测CatSper1mRNA在出生后11、15、18、21、25、28、35、42、56和120d龄C57BL／6小鼠（每天龄3只）睾丸中的表达；分别从4例正常精液标本中用四层密度梯度Percoll（浓度分别为95％、76％、57％和47．5％）离心分离出高活力和低活力精子，用于Western Blot定量检测CatSper1蛋白的表达。结果CatSper1mRNA在18d龄小鼠睾丸开始表达，在25和28d龄表达上调明显，分别为21d龄表达水平的2．95和7．59倍。自42d后上调缓慢，至成年小鼠时达到最高水平。CatSper1蛋白在每例标本高活力精子中的表达量均显著高于低活力精子（P〈0．05）。结论 CatSper1与精子活力特性有关，为进一步研究CatSper家族各成员间的关系和确切功能提供参考依据。     

尿激酶型纤溶酶原激活因子对小鼠获能精子线粒体膜电位的影响

目的:检测尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)体外对小鼠获能精子线粒体膜电位的影响。方法:采用线粒体膜电位荧光染料JC-1,利用流式细胞仪和荧光显微镜检测分别与uPA(实验组)和BWW液(对照组)共孵育0、5、15、30、60min的小鼠获能精子线粒体膜电位状态。结果:①在uPA作用第5、15min时,精子体内平均荧光强度较作用前显著增加,高膜电位的精子数量百分率相应增加(P<0.05)。②与对照组相比,实验组在uPA作用5、15min时的高膜电位精子数量百分率,以及作用15、30、60min时的精子线粒体膜电位平均荧光强度显著增加(P<0.05)。结论:uPA在体外可以增加小鼠获能精子的线粒体膜电位,并使高膜电位状态维持一段时间,为获能精子提供充足的能量供应。     

大鼠肺癌癌变过程中G1/S期调节基因的动态表达

原发性肺癌严重威胁人类生命。以往的研究工作多限于已形成的肺癌组织的某个阶段或肺癌细胞系 ,而对肺癌癌变过程中癌基因和抑癌基因的动态变化及其与肺癌的关系尚无相关报道。在本室建立的动物肺癌模型基础上 ,我们用免疫组织化学和原位杂交技术检测Ｇ1/Ｓ期转换调节基因ｐ16、ｃｙｃｌｉｎＤ1、ＣＤＫ4在大鼠肺癌癌变中的动态表达 ,以期探讨其相互关系及与肺癌发生发展的关系。材料与方法　 1.大鼠肺癌模型的建立及动物处理 :Ｗｉｓｔａｒ大鼠 92只 (购于湖北省实验动物中心 ) ,雌雄兼有 ,体重 15 0～ 180ｇ ,完全随机分为实验组和对照组…