脂肪来源干细胞诱导分化为神经元样细胞的实验研究

目的： 研究脂肪来源干细胞（ASCs）的分离、纯化、扩增以及在体外定向分化为神经元样细胞的能力。 方法: 获取并培养正常人的ASCs，倒置显微镜下观察其形态；流式细胞仪检测其免疫表型。全反式维甲酸（ATRA）诱导ASCs在体外分化为神经元样细胞，倒置显微镜观察神经元样细胞的形态，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测巢蛋白基因的表达；免疫组织化学染色法和Western blotting法检测神经丝蛋白（NF）和神经元烯醇化酶（NSE）的表达。 结果: ASCs呈纤维样贴壁生长，体外培养易扩增；ASCs表达相关抗原CD29和CD105，不表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR；不同扩增代数的ASCs经诱导剂的作用可呈现典型的神经元样细胞形态，巢蛋白基因及NF、NSE均呈阳性表达。 结论: 脂肪组织中分离培养的ASCs具有体外大量扩增并保持低分化状态的特性，以及定向分化为神经元样细胞的能力, 是一种可用于神经系统疾病治疗的种子细胞。     

参芪扶正注射液对急性髓系白血病患者调节性T细胞作用的体外研究

目的研究参芪扶正注射液对完全缓解期急性髓系白血病患者调节性T细胞的影响,探讨其调节免疫功能的机制。方法免疫磁珠法分离18例急性白血病患者的CD4 CD25 T细胞,并在IL-2作用下与不同浓度参芪扶正注射液共同培养,倒置显微镜下计数细胞,AnnexinⅤ法检测其凋亡率,酶联免疫吸附法检测其分泌IL-10的水平,逆转录聚合酶链式反应法检测参芪扶正注射液对CD4 CD25 T细胞表达FOXP3的影响。结果参芪扶正注射液对急性白血病患者CD4 CD25 T细胞的生长和凋亡率无明显影响。加入参芪扶正注射液后CD4 CD25 T细胞分泌IL-10明显减少,表达FOXP3的水平亦减少,且具有剂量依赖关系。结论参芪扶正注射液能作用于化疗后完全缓解白血病患者的调节性T细胞,通过减少其分泌IL-10及表达FOXP3的水平,从而抑制调节性T细胞的功能,减弱它对机体免疫的抑制作用,增强患者的免疫功能。     

急性髓细胞白血病细胞的吲哚胺2,3-双加氧酶介导免疫逃逸的实验研究

为了探讨急性髓细胞白血病细胞的吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）参与肿瘤免疫逃逸的机制,从23例急性髓性白血病患者获取骨髓细胞,采用免疫组织化学染色法和RT-PCR法检测白血病细胞IDO的表达;在有或无1-甲基色氨酸（1-MT）存在下,以白血病细胞为刺激细胞,外周T淋巴细胞为反应细胞建立单向混合淋巴细胞反应体系（MLR）,利用MTT法检测T淋巴细胞增殖率,并以反相高效液相色谱法检测相应MLR体系上清液中的IDO活性.结果显示,在23例急性髓细胞白血病患者中17例患者的骨髓白血病细胞上有IDO的表达;白血病细胞上的IDO活性抑制MLR体系中T淋巴细胞的增殖.结论：白血病细胞表达的IDO活性能阻抑外周T淋巴细胞的增殖,它可能参与了肿瘤免疫逃逸.     

30例80岁以上老年人急性粒细胞白血病的治疗及预后分析

目的 :了解 80岁以上老年人急性粒细胞性白血病 (AML)的临床及生物学特征、影响预后的因素 ,分析保守支持治疗的可行性。方法 :回顾性分析经FAB分型确诊的 30例 80岁以上老年AML患者的临床及生物学特征、影响预后的因素及可行性治疗方案。结果 :确诊时 ,13例 (43.3% )ECOGPS评分 >2分〔1〕;10例 (33.3% )有MDS病史 ;2 4例 (80 .0 % )有并发症 ;9例 (30 .0 % )LDH≥ 4 0 0U/L ;13例 (43.3% )血清白蛋白≤ 32g/L ;预后不良核型 11例 (36 .7% ) ;CD34+ 、CD7+ 或CD14 + 者共 12例 (40 .0 % )。 12例 (40 .0 % )仅接受支持治疗 ,18例 (6 0 .0 % )给予支持治疗同时辅以小剂量化疗及GM/G CSF治疗。中位数生存期 (OS)为 13周 (2～ 6 0周 ) ,5例 (16 .7% )OS≥ 6个月 ,3例 (10 .0 % )OS≥ 12个月。单因素分析显示PS评分 >2分 ,血清白蛋白≤ 32g/L ,白细胞≥ 5 0× 10 9/L和预后不良核型为OS的负面影响因素。结论 :80岁以上AML患者有特殊的临床和生物学特征 ,治疗以保守治疗为主 ,必要时可根据病情辅以小剂量化疗 ,其预后与多种因素有关。     

人脐静脉来源间充质干细胞向神经样细胞分化的体外分离扩增实验

目的:探讨人脐静脉来源的间充质干细胞的体外分离、纯化、扩增及向神经元样细胞的定向分化,为间充质干细胞治疗神经系统疾病提供实验依据。方法:实验于2004-06/2005-03在华中科技大学同济医学院附属协和医院血研所完成。无菌条件下取正常人脐静脉,10g/L胶原酶Ⅱ消化脐静脉内皮细胞,以IM DM作为培养基进行培养和纯化细胞,检测其生物学特点;用全反式维甲酸诱导,倒置相差显微镜观察诱导前后细胞的形态;免疫组织化学、免疫荧光化学和W estern blot方法检测分化前后细胞上的神经丝蛋白和胶质纤维酸性蛋白的表达。结果:脐静脉来源的细胞呈纤维样贴壁生长,具有骨髓间充质干细胞的生物学特征;诱导分化后,大部分间充质干细胞呈现典型神经样细胞形态,出现神经丝蛋白和胶质纤维酸性蛋白表达。结论:人脐静脉可以分离培养出间充质干细胞,并可以在体外定向分化为神经样细胞,为神经系统疾病的治疗提供细胞来源。     

老年急性髓系白血病去甲基化药物治疗进展

正目前急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中位诊断年龄68岁,随着年龄增长,患者主要脏器基础疾病、药物清除率下降、免疫及认知能力下降等不利因素的发生率上升,高危核型和分子学异常如FLT3-ITD突变、多重耐药、前驱血液病史和干细胞储备下降等疾病因素显著增多,疗效也明显下降~[1]。如何有效治疗老年AML是当前一大挑战,其中去甲基化药物(hypomethylating agents,HMA)较传统强化疗方案具有一定的疗效     

黄连解毒汤抑制多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增生及促凋亡作用的研究

 目的 研究中药黄连解毒汤（HLJDT）对人多发性骨髓瘤（MM）细胞RPMI8226增生和凋亡的作用。方法 以含10 ％胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养RPMI8226细胞,分别以不同浓度的HLJDT作用不同的时间后,应用锥虫蓝拒染法测定细胞活力变化,MTT法检测细胞的增生变化;采用流式细胞术测定细胞周期的变化;应用流式细胞仪检测药物细胞的凋亡现象,荧光显微镜下观察AO／EB染色后的细胞凋亡形态变化;比色法检测半胱氨酸蛋白水解酶3（caspase3）活性变化。结果 与对照组相比,200～800 ng／ml浓度的HLJDT可明显抑制细胞增生影响（P＜0.01）,并呈时间和剂量依赖性;使细胞周期阻滞在G0／G1期细胞增多,S期细胞减少,并呈剂量依赖性改变; MM细胞凋亡百分率显著增高（P＜0.01）,免疫荧光显微镜下可见典型的凋亡细胞形态学变化;使caspase3活性增强,且呈剂量和时间依赖性（P＜0.01）。结论 HLJDT能有效抑制MM细胞RPMI8226增生,促其凋亡,G0／G1期细胞比例增加和S期细胞比例减少可能是原因之一;caspase3活性增强可能参与其凋亡过程,具体机制研究还有待完善。     

siRNA特异性抑制K562细胞Livin基因表达及其诱导凋亡作用

本研究探讨小分子RNA干扰技术抑制livin基因表达对白血病细胞系K562细胞凋亡的影响。设计合成livin特异性小干扰RNA(siRNA),核转染K562细胞,培养转染后的K562细胞,用RT-PCR检测livin mRNA的表达,Western blot检测Livin蛋白的表达。以未转染细胞作对照,同时转染带有增强型绿色荧光蛋白的载体作为阳性对照,用流式细胞术检测其细胞绿色荧光以确定转染效率。用膜联蛋白Ⅴ及碘化丙锭双染法检测细胞凋亡率。结果表明,电穿孔的转染效率可达50%。siRNA既可以抑制livin mRNA表达,也可以抑制livin蛋白表达。特异性siRNA转染细胞后48 h细胞凋亡率为(27.41±2.30)%,与对照组(9.63±0.89%)比较明显提高(P<0.05)。结论:SiRNA可以抑制livin基因的表达,并能抑制livin基因的抗凋亡作用。     

脂肪基质干细胞对异基因T淋巴细胞的作用及机制探讨

目的：研究脂肪基质干细胞（ASC）对异基因T淋巴细胞的作用,探讨ASC发挥免疫调节作用的方式和可能机制。方法：将ASC上清和ASC分别与异基因T淋巴细胞进行混合培养。MTT法检测T细胞的增殖,AnnexinⅤ法检测凋亡,流式细胞术检测T细胞中CD4^＋CD25^＋细胞的比例,ELISA法检测T细胞分泌IL-10和TGF-β1的水平,RT-PCR法检测Foxp3基因的表达。结果：ASC上清对T淋巴细胞的增殖和凋亡无明显影响。ASC对T淋巴细胞的生长有抑制作用,但对其凋亡无影响。ASC上清和ASC均能增加CD4^＋CD25^＋T细胞在T淋巴细胞中的比例,增加T细胞分泌IL-10和TGF-β1的水平,上调Foxp3基因的表达。结论：ASC能通过细胞直接接触和分泌细胞因子的方式分别作用于T淋巴细胞,发挥免疫负调节作用。     

小白菊内酯对多发性骨髓瘤细胞蛋白酶体活性及白细胞介素-6表达的影响

目的探讨小白菊内酯(parthenolide,PTL)对多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞蛋白酶体活性及白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)表达的影响,以期了解PTL抗MM的分子机制。方法2006年5月至2007年3月华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所,体外培养人MM细胞系PRMI8266,与不同浓度的PTL作用不同时间。以荧光底物法检测细胞蛋白酶体活性,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-6基因表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测MM细胞培养上清中IL-6的质量浓度。结果2~10μmol/L的PTL作用16h对PRMI8266细胞蛋白酶体的糜蛋白酶活性具有明显抑制作用,其效应呈现浓度依赖性;10μmol/L可达到接近50%的活性抑制。RT-PCR检测结果表明,2,5,10μmol/L的PTL作用24h,MM细胞的IL-6基因 mRNA表达强度与对照相比均明显降低;2,5,10μmol/L的PTL作用MM细胞48h后,培养上清中IL-6质量浓度分别为(92.6±4.3)ng/L、(67.1±5.7)ng/L、(43.5±4.9)ng/L,与对照组(148.7±8.2)ng/L相比,差异有显著性意义(P<0.01)。结论PTL能明显抑制PRMI8266细胞的蛋白酶体活性,降低IL-6基因表达,减少MM细胞IL-6的自分泌。提示PTL抑制蛋白酶体活性及IL-6表达可能是其抗MM的机制之一。