人胎盘血间质干细胞分离培养

目的：分离培养人胎盘血间质干细胞（hMSC），为hMSC探寻新来源。方法：采用羟乙基淀粉（HES）方法分离、富集胎盘血有核细胞；DMEM培养液体外培养、纯化、扩增hMSC；流式细胞仪检测细胞表面标记；地塞米松、IBMX、胰岛素和吲哚美辛定向诱导hMSC样细胞向脂肪细胞分化。结果：胎盘血来源有核细胞,在DMEM体外培养条件下，生长出具有塑料粘附特性的梭形细胞，阳性获得率29.17%（7/24），该细胞传代培养达6个月以上；流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD59、CD90、CD105、CD166表达阳性，CD14、CD34、CD45、CD80、CD86表达阴性；加入脂肪细胞诱导剂，细胞在形态上向脂肪细胞转化，胞内出现脂滴、脂泡，油红O阳性。结论：人胎盘血可以分离培养出hMSC，是hMSC的重要来源。     

BDNF重组腺病毒的构建及在大鼠骨髓间质干细胞的表达

目的:利用大肠杆菌细菌内同源重组构建带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的脑源性神经营养因子前体(proBDNF)和脑源性神经营养因子(BDNF)重组腺病毒并在大鼠骨髓间质干细胞(rMSC)高效表达。方法:采用两步亚克隆的方法将proBDNF和BDNF构建入带有EGFP表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移载体pAdTrack-proBDNF和pAdTrack-BDNF,采用化学转化法在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd-proBDNF和pAd-BDNF;转染293细胞,包装成重组病毒颗粒;将重组病毒上清感染rMSC,用荧光显微镜下观察和Western-blotting鉴定重组病毒在rMSC表达;用Ad-proBDNF和Ad-BDNF感染的rMSC在体外诱导向神经样细胞分化;用Ad-proBDNF和Ad-BDNF的感染的rMSC接种于裸鼠肌肉内,两周后荧光显微镜下直接观察。结果:成功地构建了proBDNF和BDNF重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒,重组病毒能在体外培养的rMSC高效表达并不影响其分化潜能,体内移植实验表明Ad-proBDNF和Ad-BDNF感染的rMSC能在体内表达。结论:重组腺病毒具有较高的介导proBDNF和BDNF基因表达于rMSC的效率,带有报告基因EGFP的Ad-proBDNF和Ad-BDNF感染的rMSC可以用于体内移植实验。     

长期传代的大鼠骨髓间质干细胞的生物学特性分析

目的:通过对大鼠骨髓间质干细胞(BMMSC)体外长期传代培养, 进一步了解其增殖、表型变化及是否有突变倾向。方法:用流式细胞仪分析80％融合生长的传代细胞的细胞周期、表型变化;并对早期和长期传代的BMMSC进行核型对比分析。结果:早期和长期传代(30代)的BMMSC均呈现旺盛的的增殖力, 但40代BMMSC的表型与20代以前则有所不同;早期和长期传代的BMMSC均显示正常核型。结论:大鼠BMMSC可简便迅速地在体外长期扩增, 在保持这种高增殖力的同时, 核型仍保持正常二倍体;长期传代的BMMSC的表型变化提示其有一定自发分化趋势。     

活血利水法预防下肢骨折术后深静脉血栓形成的疗效研究

[目的]观察活血利水法预防下肢骨折术后深静脉血栓形成(DVT)的临床疗效.[方法]根据一般情况及骨折分类将200例下肢骨折术后病例按照分层随机化法分为试验组、对照组各100例.根据《中国骨科大手术静脉血栓栓塞症预防指南》,2组予以相同的综合预防方案,同时试验组予以活血利水法代表方剂活血通脉汤治疗,每日1剂,连续14 d.分别观察2组术后第1天、第5天、第14天血清D-二聚体(D-D)、纤维蛋白原(Fg)水平并行伤肢彩色多普勒超声检查.[结果](1)术后第1天,2组的血清D-D、Fg水平比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).术后第5天、第14天,2组的血清D-D、Fg水平逐步下降,与术后第1天比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);且试验组下降较同期对照组显著,差异均有统计学意义(P＜0.05),表明试验组在降低患者的血清D-D、Fg水平方面优于对照组;(2)彩色多普勒超声检查显示:术后第1天,2组伤肢DVT发生率比较,差异无统计学意义(P＞0.05);术后第5天、第14天,试验组伤肢DVT发生率均显著低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).[结论]根据《中国骨科大手术静脉血栓栓塞症预防指南》制定综合预防方案,同时配合中医活血利水法治疗,能够降低下肢骨折术后血清D-二聚体、纤维蛋白原水平,预防伤肢深静脉血栓形成.     

中性粒细胞抑制人单个核细胞释放TNF-α及其机理的研究

目的:探讨人中性粒细胞(PMNs)对人外周血单个核细胞(PBMCs)释放TNF-α的影响及其作用机理。方法:采集健康供血者的新鲜外周静脉血,以葡聚糖沉淀和密度梯度离心法分离其PMNs和PBMCs,将PMNs细胞与PBMCs细胞按2:1的数量比与脂多糖共同培育后,分别采用酶联免疫吸附法测定培养上清的TNF-α浓度,并用流式细胞术测定结合荧光标记脂多糖的单核细胞的百分率及单核细胞表面平均荧光强度。结果:PMNs在细菌脂多糖刺激下不释放TNF-α,PMNs可以抑制PBMCs释放TNF-α,其抑制作用具有细胞特异性;经多聚甲醛固定的PMNs仍具有上述的抑制作用。流式细胞术结果显示PMNs并不影响单核细胞与脂多糖结合。结论:PMNs可抑制人PBMCs释放TNF-α,其机理可能是PMNs干扰脂多糖激活PBMCs的信号转导过程,抑制细菌脂多糖对其的活化,从而下调TNF-α的释放。     

供者源性的骨髓间质干细胞对急性移植物抗宿主病的影响

目的:采用大鼠骨髓移植模型探讨共移植供者源性的骨髓间质干细胞(MSCs)对骨髓移植后急性移植物抗宿主病(GVHD)的影响。方法:体外培养Fisher344大鼠骨髓间质干细胞,扩增至第5代用于移植。建立大鼠异基因急性GVHD模型(F344→Wistar)。受者Wistar大鼠采用致死性全身照射预处理,当天移植F344大鼠骨髓细胞和脾细胞。实验组则移植F344大鼠骨髓细胞、脾细胞和第5代的MSCs。观察各组移植后急性GVHD的发生时间、发病率和存活时间。结果:共移植MSCs推迟急性GVHD的发病时间,延长该组的存活时间,但无法完全消除急性GVHD的发生。结论:MSCs在体内具有免疫抑制功能,供者来源的MSCs在不使用免疫抑制剂情况下,可推迟急性GVHD的发病时间和延长受者的存活时间。     

胎肝条件培养液体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为造血细胞的研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）体外造血分化潜能。方法： 选用孕12.5-14.5 d（12.5-14.5 dpc）的昆明小鼠，分别制备小鼠胎肝基质细胞条件培养液（FLSC-CM）及胚胎成纤维细胞饲养层（FD），将体外扩增的CD34-CD45-hMSCs分别接种于含FLSC-CM、FD和IL-6及SCF组合的培养体系中，培养7 d后，通过形态学、表型、粒-单/巨噬细胞系集落培养（CFU-GM）对分化细胞进行鉴定。结果： hMSCs与FLSC-CM共培养组产生的非贴壁细胞明显增多，形态类似于单核或小淋巴细胞，部分细胞可表达人造血细胞特异性表面分子（CD34和CD45），在含人粒-单集落刺激因子（GM-CSF）的甲基纤维素培养体系中能够形成CFU-GM，而FD和IL-6+SCF诱导组无上述作用。结论： FLSC-CM可诱导CD34-CD45-hMSCs分化为造血细胞，提示hMSCs具有体外造血分化潜能。     

中性粒细胞抑制人单个核细胞释放TNF-α及其机制的研究

目的探讨人中性粒细胞(PMNs)对人外周血单个核细胞(PBMCs)释放TNF-α的影响及其作用的初步机理.方法采集健康供血者的新鲜外周静脉血,以葡聚糖沉淀和密度梯度离心法分离其PMNs和PBMCs,将PMNs与PBMCs按2∶1的数量比与脂多糖共同培育后,分别采用酶联免疫吸附法测定培养上清的TNF-α浓度,并用流式细胞测定结合荧光标记脂多糖的单核细胞的百分率及单核细胞表面平均荧光强度.结果PMNs在细菌脂多糖刺激下不释放TNF-α,PMNs可以抑制PBMCs释放TNF-α,其抑制作用具有细胞特异性;经多聚甲醛固定的PMNs仍具有上述的抑制作用.流式细胞仪结果显示PMNs并不影响单核细胞与脂多糖结合.结论PMNs可抑制人PBMCs释放TNF-α,其机理可能是PMNs干扰了脂多糖激活PBMCs的信号转导过程,抑制细菌脂多糖对其的活化,从而下调TNF-α的释放.     

体外阻断CD40-CD40L共刺激途径减轻小鼠异基因骨髓移植中移植物抗宿主病的研究

目的在异基因骨髓移植移植物抗宿主病(GVHD)小鼠模型中,观察抗CD40L单克隆抗体(单抗)体外预处理供鼠T细胞输注,观察其减轻GVHD的作用并探讨其作用机制.方法供鼠(C57BL/6H-2b)脾T细胞作为反应细胞,受鼠(BALB/cH-2d)脾细胞作为刺激细胞,分别加抗CD40L单抗或不加单抗进行混合培养,培养第5天的细胞作为经体外诱导后的脾T淋巴细胞,分别混合供鼠骨髓细胞后移植给接受8.0 Gy全身照射预处理的受鼠.比较受鼠GVHD发生和造血重建.在移植后不同时间点采用流式细胞仪检测受鼠脾细胞中T细胞表型的改变,用ELISA法检测外周血血清中Th1和Th2类细胞因子的水平.结果移植后对照组受鼠均于25 d内死于GVHD,实验组GVHD的发生率为20%,与对照组小鼠相比,存活率和存活时间明显增高和延长(P<0.01);存活的实验组小鼠(8只)第40天时骨髓细胞中H-2Db阳性细胞为(93.54±2.32)%.实验组小鼠CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD8+CD25+、CD4+CD40L+和CD8+CD69+T细胞比例明显低于对照组(P<0.05),CD8+CD40L+和CD4+CD45RA+T细胞比例在两组中变化差异无显著性(P>0.05).实验组受鼠血清中细胞因子水平明显低于对照组(P<0.05).结论应用抗CD40L单抗体外孵育的脾T细胞与骨髓细胞混合移植,可明显减少GVHD的发生率,且不影响供鼠造血干细胞的植入,CD4+和CD8+T细胞对异体抗原发生耐受,耐受化T 细胞的活化障碍发生于活化的早期和成熟阶段,同时抑制了Th1和Th2类细胞因子分泌,为抗CD40L单抗应用于临床移植预防GVHD提供了实验依据.     

树突状细胞诱导T细胞免疫耐受的机理

DC是一类专职的抗原呈递细胞 ,不仅具有强大的免疫应答诱导能力 ,而且能够通过多种机制诱导T细胞产生抗原特异性免疫耐受 ,这些机制包括诱导T细胞无能、专职地释放免疫抑制性细胞因子、介导T细胞的克隆清除、诱导和募集调节性T细胞和诱导免疫偏离。DC诱导免疫耐受机制研究的深入必将为DC的临床应用提供更坚实的基础。