轮状病毒结构蛋白VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位的初步鉴定

目的预测并初步鉴定轮状病毒Wa株结构蛋白VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位,为轮状病毒免疫保护机制研究及疫苗的研制奠定基础.方法应用表位亲和力预测软件SYFPEITHI及蛋白酶切位点预测软件PAProc和Fragpredict相结合预测VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位;用分子模拟对候选肽作进一步筛选;标准Fmoc方案合成候选肽,RP-HPLC纯化、分析,质谱进行鉴定;最后用T2细胞株测定候选肽与HLA-A*0201分子的亲和力及稳定性.结果结合SYFPEITHI、蛋白酶切位点预测结果及分子模建结果,选择分值最高同时在C-末端含有蛋白酶切位点的4条肽作为候选表位肽;标准Fmoc方案合成的各肽纯度均大于95%,质谱检测结果表明,各肽的相对分子质量与理论值基本一致;在候选的4条表位肽中,TLLANVTAV(340-348)和VLADANETL(333-341)与HLA-A*0201呈高亲和力结合,荧光系数(flurorescene index,FI)分别为2.66和2.64,同时肽-HLA-A*0201复合物半数解离时间(dissociation complex50,DC50)均大于8 h.结论TLLANVTAV(340-348)和VLADANETL(333-341)为潜在的HLA-A*0201限制性CTL表位.     

人源轮状病毒vp7基因的克隆与转基因植物研究

目的：克隆人源轮状病毒外壳蛋白vp7基因，以制备转基因植物疫苗。方法：用RT-PCR方法制备vp7基因，以植物高效表达质粒PBI121为载体，构建重组DNA质粒。重组体用载体上的通用引物为测序引物，鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用农杆菌介导法转染马铃薯外植体，分别用PCR、Western blot法鉴定阳性转化植株中vp7基因的表达。结果：成功地将vp7转入马铃薯植株中，并且在转化植株中检测出了vp7的表达。结论：成功地构建了重组PBI121/hvp7质粒，获得表达外源基因vp7的转基因马铃薯。     

双向电泳分析比较维甲酸诱导HL60细胞分化的蛋白表达差异

目的：以维甲酸诱导急性早幼粒白血病细胞HL60分化为模型，用双向电泳技术分析比较维甲酸诱导HL60细胞分化的蛋白表达差异。方法：用细胞生物学的方法分析分化细胞形态上的差异，NBT实验检测细胞NBT阳性率。用双向电泳技术分析分化肿瘤细胞蛋白表达差异。结果：分化后细胞形态发生明显变化，细胞表面出现突起，细胞核变小。分化后细胞NBT阳性率达90％以上，而未分化细胞NBT阳性率低于5％。双向电泳技术分析发现有7个蛋白点只未分化细胞检测到表达，而分化细胞未检测到；有14个蛋白点只在分化细胞检测到。结论：双向电泳技术可直接反映细胞蛋白表达变化。     

NK细胞与肝纤维化关系的研究进展

以活化的肝星状细胞为中心的局部免疫微环境在肝纤维化的发展中起着关键作用。而近年来一些研究表明NK细胞可通过产生具有抗纤维化作用的IFN-γ并且直接杀死活化HSCs,起到明显的抗肝纤维化作用。因此,刺激NK细胞活化极可能成为治疗肝纤维化的新途径。     

轮状病毒不同毒株感染宿主细胞的感染效力研究

目的 比较轮状病毒Wa株和SA11株对MA104细胞的感染及复制能力,研究不同毒株对宿主细胞的感染效力.方法 差速离心浓缩病毒颗粒,FFA法检测病毒滴度,流式细胞术检测病毒对MA104细胞的感染效率,ELISA检测不同病毒颗粒浓度,并比较2毒株间异同.结果 Wa株感染效率随病毒量的变化明显快于SA11株,极限感染效率也较SA11高;2毒株病毒产量均随感染病毒用量增加而明显升高,而感染了SA11细胞的平均病毒生成能力显著高于感染Wa株的细胞.结论 轮状病毒Wa株与SA11株感染细胞效力差异显著(P＜0.05),为进一步研究轮状病毒感染宿主细胞及与之相互作用特点提供了实验依据.     

基于Survivin的模拟病毒瘤苗体外激发CTL杀伤活性的实验研究

目的探讨基于Survivin的模拟病毒瘤苗体外激发细胞毒性T细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)对乳腺癌细胞的杀伤作用。方法制备含有Survivin的模拟病毒瘤苗,体外刺激HLA-A2·1阳性健康者外周血单个核细胞(peripheralbloodmononu-clearcell,PBMC),用酶联免疫斑点实验(enzymelinkedimmunospotassay,ELISPOT)和标准51Cr释放实验分别检测瘤苗所诱导的特异性CTL活性。结果Survivin模拟病毒瘤苗能够在体外诱导出特异性CTL,对HLA-A2·1阳性的乳腺癌细胞系MCF-7有明显的杀伤毒性,杀伤率为56·4%;并可诱导CTL产生IFN-γ等细胞因子,ELISPOT显示斑点数为287个/105细胞,P<0·05。结论模拟病毒瘤苗能有效激发出特异性CTL应答,为新型乳腺癌治疗性疫苗的设计提供了新思路。     

mRNA疫苗制备方法的优化及验证北大核心CSCD

目的筛选获得高效的mRNA疫苗制备方法,为mRNA疫苗研发提供参考。方法本研究使用了A、B、C三种不同的mRNA疫苗体外合成方法,比较筛选出最优方法并在小鼠体内进行了效果验证。结果3种方式合成的mRNA凝胶电泳条带清晰、完整,紫外分光光度法测定mRNA OD_(260nm)/OD_(280nm)均在1.9~2.0的范围之内,纯度较好。其中,C方法转录后mRNA的浓度最高且体外转录的eGFP mRNA转染细胞后,其表达量更高,持续时间更长。动物体内活体成像也表明,C方法转录的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)mRNA经脂质纳米颗粒递送可在动物体内高效表达,并且经该方法合成的登革病毒mRNA疫苗接种小鼠21 d后可产生体液免疫。结论通过对比筛选出的C方法为mRNA疫苗制备的最佳方法,可用于后续各类mRNA疫苗研发。     

登革病毒多价DNA疫苗构建及免疫保护效果验证北大核心CSCD

目的研究登革病毒(dengue virus,DENV)的多价DNA疫苗pVAX1-EDIII在小鼠体内的免疫原性及其保护作用。方法采用真核表达载体p VAX1,设计并构建含4种血清型登革病毒EDIII结构域的DNA疫苗。在第0、14和42天采用电脉冲肌肉导入方式免疫小鼠。末次免疫后1周,ELISA检测针对4种血清型登革病毒的血清特异性IgG抗体水平;ELISpot检测免疫后小鼠脾细胞分泌特异性IL-4、IFN-γ的水平;体内中和实验检测小鼠免疫后血清对感染DENV和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)乳鼠的保护效力。结果与对照组相比,电脉冲肌肉导入DNA疫苗诱导产生较高滴度的IgG抗体与较强的细胞免疫应答。免疫后血清对致死剂量DENV感染的3日龄乳鼠有完全保护作用,对ZIKV感染C57BL/c 1日龄乳鼠有部分保护作用。结论电脉冲肌肉导入登革DNA多价疫苗免疫可诱导针对4种血清型登革病毒的特异性体液免疫以及细胞免疫应答并能有效抵抗DENV的致死剂量攻毒,对ZIKV也能产生一定的保护效应,具有广谱抗黄病毒感染的潜力。     

Hsp90抑制剂CH5138303抗轮状病毒感染的作用研究北大核心CSCD

目的研究Hsp90抑制剂CH5138303在抗轮状病毒感染中的作用。方法使用人肠上皮细胞Caco-2感染轮状病毒Wa株模型评价CH5138303对轮状病毒感染的作用,流式细胞术评价CH5138303抑制轮状病毒Wa株感染肠上皮细胞Caco-2感染效率;同时通过检测新生病毒的滴度评价高、低浓度(10μmol/L、1μmol/L)CH5138303抑制活性轮状病毒的生成效果;进一步,使用乳鼠体内实验,评价口服CH5138303抑制轮状病毒感染导致腹泻发生程度及重症致死性轮状病毒感染的死亡率。结果(1)CH5138303显著抑制轮状病毒感染建立;(2)CH5138303强烈抑制活性轮状病毒的生成;(3)不同浓度(10μmol/L、1μmol/L)CH5138303抑制效率分别为90%及80%;(4)CH5138303显著缓解轮状病毒乳鼠腹泻症状;(5)CH5138303显著降低重症致死性轮状病毒感染模型中小鼠死亡率;(6)CH5138303细胞毒性较常见的Hsp90抑制剂格尔德霉素、17-AAG显著较低。结论Hsp90抑制剂CH5138303能显著抑制轮状病毒复制,延缓轮状病毒腹泻的发生,特别是有效的降低重症致死性轮状病毒腹泻的发生,从而有助于高效特异性抗轮状病毒药物的开发。