表达pCDR1 Th表位减毒鼠伤寒沙门菌株的构建

目的构建表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株。方法全基因合成pCDR1两条核苷酸链,在C端加上6-His标签,退火互补后插入原核表达载体pYA3149中,构建重组质粒pR1,将该重组质粒转入鼠沙门菌终宿主菌株X4550,获得杂合菌株X4550（pR1）。体外诱导表达后斑点印迹鉴定表位肽的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。体外诱导后6h细菌裂解上清液中,检测到表位肽的表达,该蛋白能与鼠抗His单克隆抗体特异结合。重组菌株在体外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖。结论成功构建了能稳定表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位W/O/W型复乳剂的研制

目的 制备重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(rUreB)复乳剂，研究其物理性质及免疫效率。方法 设计处方采用二步法制备复乳，显微镜观察乳滴结构及粒径分布，以电导法测定包封率，以经典法、离心法及电导法观察复乳的稳定性，免疫印迹观察抗原制备成复乳剂后免疫反应性的变化，以动物实验观察rUreB复乳的免疫效率。结果 制备的rUreB复乳性质稳定、包封率98．3％、粒径大小主要在2～10μm，免疫印迹及小鼠口服免疫后特异性抗体测定结果表明，该复乳具有良好的免疫原性，剂量小、免疫效率高。结论 将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位制备成复乳剂可得到高效、廉价、使用方便的疫苗，复乳是一个很有潜力的黏膜疫苗传送系统。     

戊型肝炎病毒感染HepG2细胞蛋白质组学研究

比较人肝癌细胞系HepG2细胞感染和未感染HEV后细胞内蛋白质表达谱的变化,为初步探索HEV在宿主细胞内感染机制及致病机理奠定基础。方法 RT-nPCR和免疫荧光确认HEV感染HepG2细胞后,利用同位素标记相对和绝对定量( isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术比较HEV感染组与未感染组HepG2细胞蛋白质表达差异。结果 HEV感染导致328种蛋白发生变化,与未感染组相比,262种蛋白表达上调,66种蛋白表达下调。结论 HEV感染HepG2细胞导致大量蛋白差异表达,功能预测表明这些蛋白涉及到宿主的物质代谢、细胞信号转导、免疫蛋白、细胞骨架成分等方面,为今后研究HEV感染机制和致病机理奠定基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位核酸疫苗的构建及鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌HpureB基因,并构建其核酸疫苗。方法:以HpNCTC11637株基因组DNA为模板,用PCR扩增ureB基因,并亚克隆至pMD18-T载体中。将目的基因经SalI、BglⅡ酶切纯化后插入pTCAE中,转化E.coliDH5α。经SalI、XhoI酶切并测序鉴定的阳性重组质粒命名为pT-ureB。以电穿孔法将pT-ureB转染CHO细胞,用Wes-tern blot检测UreB蛋白的表达。结果:克隆重组后得到pT-ureB。将pT-ureB以电穿孔法转染CHO细胞后,取其培养上清进行Western blot检测,在UreB的相对分子质量(Mr)为62000处出现特异性条带。结论:成功地构建了HpureB核酸疫苗。体外转染CHO细胞后,经Western blot检测证实有UreB蛋白的表达,为进一步的相关研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌感染小鼠及其抗原免疫小鼠后体液免疫应答的比较

目的：比较BALB／c小鼠感染H.pylori后以及经H.pylori UreB抗原口服免疫后的体液免疫应答的差异。方法：80只BALB／c小鼠分为感染组和免疫组，感染组灌喂H.pylori小鼠适应株；免疫组灌喂重组H.pylori UreB抗原和佐剂LTB。在试验的0，2，6和10周时每组分别取10只小鼠收集唾液及血液标本，用ELISA法检测抗UreBIgG和IgA抗体，同时采集胃组织作H.pylori感染检测。结果：感染组小鼠在灌喂H.pylori后2，6，10周，感染率均为100％，其血清中抗UreB IgG增高明显，但血清及唾液中均未见IgA的明显升高，；免疫组小鼠在初次免疫后第6，10周后，血清及唾液中抗UreB,IgG和IgA抗体的均显著升高。结论：H.yplori感染BALB／ c小鼠不能诱导其产生明显的特异性黏膜免疫应答，而重组UreB可作为良好的免疫原诱导其产生分泌型IgA抗体。     

与甲型副伤寒杆菌噬菌体LSPA1早期蛋白GP23相互作用的宿主蛋白的筛选

目的 筛选与甲型副伤寒杆菌(副甲)CMCC50973噬菌体LSPA1早期蛋白GP23相互作用的宿主蛋白。方法 Sau3AⅠ酶切副甲基因组, 回收250~1 500 bp的条带与pAT质粒连接, 构建pAT-副甲基因文库;扩增噬菌体早期基因gp23, 与pBT构建pBT-gp23作为诱饵质粒;将pAT-副甲基因文库和pBT-gp23共转KS宿主菌, 利用细菌双杂交技术筛选蓝色单菌。检测筛选出阳性单菌的LacZ活性, 并提质粒测序, 分析其编码蛋白。结果 成功构建副甲基因文库, 其库容量满足实验的要求, 基因文库阳性率接近100%;筛选出的插入基因为编码嘌呤透性酶。结论 宿主蛋白(嘌呤透性酶)可能与副甲噬菌体LSPA1早期蛋白GP23有相互作用。     

重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗鼻腔免疫的实验研究

目的:探讨基因工程疫苗Hp重组尿素酶B亚单位(rUreB)鼻腔接种的免疫效果。方法:以rUreB不同剂量或加不同佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠。末次免疫7 d后,收集血清及胃黏膜、小肠黏膜、鼻黏膜及气管黏膜冲洗液,用ELISA法检测抗rUreB特异性抗体。结果:rUreB鼻腔免疫后各实验组血清特异性IgG及各黏膜冲洗液中特异性IgA的水平均明显增高,与对照组相比较差异显著(P<0.01)。20μg剂量组与10μg剂量组相比较,仅血清特异性IgG水平增高,其它黏膜特异性IgA的水平未见增高。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂效果较霍乱毒素B亚单位(CTB)强,卡泊波可增强鼻腔接种疫苗在胃黏膜洗液中的抗体应答水平。结论:CTB、LTB、卡泊波均可作为rUreB鼻腔黏膜接种的佐剂。HprUreB鼻黏膜接种,不仅可诱导血清特异性抗体反应,而且能引起多个黏膜部位的免疫应答,是一种方便、有效、廉价的免疫途径。     

表达核小体Th表位减毒鼠伤寒沙门菌株的构建

目的:构建表达核小体Th表位(H2B14-28)的口服减毒鼠伤寒沙门菌株。方法:将H2B14-28基因插入原核表达载体pYA3149中,构建重组质粒pH2B(pYA3149-H2B14-28)后,转入鼠沙门菌株X4550,斑点印迹鉴定表位肽的表达。观察X4550(pH2B)体内外携带重组质粒的稳定性。结果:酶切鉴定和基因测序显示pH2B构建成功。斑点印迹证实表位肽的表达。重组菌株在体内、外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖。结论:成功构建了能稳定表达核小体Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株,为进一步直接应用减毒鼠伤寒沙门菌活菌苗在肠道内表达抗原诱导SLE免疫耐受奠定基础。     

重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性。结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg。结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性。