ConA激活的小鼠T细胞CD69表达动力学的体内外研究

目的 为明确ＣＤ６９体内外表达动力学并进一步探讨其作用。方法 ＣｏｎＡ体内外刺激小鼠Ｔ细胞后,选取不同时间点,流式细胞仪观察Ｔ细胞ＣＥ６９表达率。结果ＣｏｎＡ刺激后２ｈＣＤ６９即有明显表达,６～８ｈ达到峰值,ＣＤ８＾＝与ＣＤ８＾＋Ｔ细胞相比无明显差异。体外条件对ＣＤ６９的表达有显著的影响。结论 结果提示ＣＤ８＾－和ＣＤ８＾＋Ｔ细胞的活化均需要ＣＤ６９的参与,Ｔ细胞可能在活化早期一过性高表达ＣＤ６９     

孕酮对人T淋巴细胞体外活化CD69表达的作用

目的：探讨孕酮（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ,Ｐｒｏｇ）及地塞米松（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ,Ｄｅｘ）对人外周血Ｔ淋巴细胞体外活化ＣＤ６９表达的作用。方法：以女性健康志愿者（１０名）为研究对象,以蛋白激酶Ｃ的刺激剂佛波醇酯（Ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒ,ＰＤＢ）为Ｔ淋巴细胞的活化剂,采用双荧光染色流式细胞技术。检测ＣＤ３＾＋的Ｔ淋巴细胞表达早期活化表面分子ＣＤ６９的百分率,以观察Ｐｒｏｇ、Ｄｅｘ及Ｐｒｏ０ｇ加上Ｄｅｘ对外周血Ｔ淋巴细胞体外活化的作用。结果：在体外培养条件下,无论单独使用Ｐｒｏｇ还是Ｄｅｘ均地强低剂量ＰＤＢ刺激ＣＤ６９的表达。然而,与单独使用Ｐｒｏｇ或Ｄｅｘ的作用相比。Ｐｒｏｇ加上Ｄｅｘ明显减弱低剂量ＰＤＢ的活化ＣＤ６９的表达。结论：同时使用Ｐｒｏｇ与Ｄｅｘ可明显抑制Ｔ淋巴细胞的体外活化,提示在临床上     

凋亡细胞体外抑制T细胞活化

目的：研究凋亡细胞对Ｔ细胞活化的影响。方法：以ＣｏｎＡ刺激小鼠脾细胞增殖体系为研究对象,观察凋亡细胞预处理后对ＣｏｎＡ刺激的脾细胞ＣＤ６９表达的影响。结果：凋亡细胞可以抑制Ｔ细胞活化,而活细胞或坏死细胞却不能。同时抑制效果与凋亡种类诱导方式无关,而与凋亡细胞数量密切相关。结论：研究证明了凋亡细胞可以主动抑制Ｔ细胞活化,这一发现拓宽了目前对凋亡的认识,表明凋亡细胞主动调节免疫反应在一些生命的基本现象     

IL-6诱导血管内皮细胞纤溶相关蛋白的表达

目的:观察IL-6对脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)表达组织纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)的影响.方法:用生长良好的第2、3代HUVECs细胞进行实验,用CCK-8测定IL-6(0.125、0.25、0.5、1.2 ng/ml)作用前后细胞活性;用发色底物法测定0.5 ng/ml IL-6组和对照组(不加IL-6)培养上清液中tPA、PAI-1活性;进一步用RT-PCR检测细胞内tPA和PAI-1 mRNA水平.结果:与对照组相比, IL-6(≤0.5 ng/ml)对细胞增殖活性的影响无差异性.0.5 ng/ml IL-6组tPA活性在12～72 h显著升高(P<0.05),且显著上调tPA mRNA,12 h达到峰值,以后渐降,48 h mRNA达正常水平.而IL-6组PAI-1活性与PAI-1 mRNA表达与对照组无差异性.结论: IL-6可活化内皮细胞,显著上调HUVECs的tPA mRNA的转录和tPA分泌,诱发纤溶系统活化,而对PAI-1 mRNA或PAI-1活性无影响.IL-6的这种效应在炎症反应的病理生理过程中可能发挥重要作用.     

银杏内酯B对小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖与凋亡的影响

目的银杏内酯B(GB)是已知的天然而强效的血小板激活因子(PAF)受体(PAFR)拮抗剂,本文研究GB对小鼠T淋巴细胞活化、增殖及凋亡3大体外行为的影响,初步探讨其潜在的免疫调节作用与机制,从而为临床应用提供可靠的实验依据。方法分离小鼠淋巴细胞,培养前以不同浓度的GB预孵;以刀豆蛋白A(Con A)诱导细胞的活化与增殖,以荧光抗体双色标记(anti-CD3 mAb-PE/anti-CD69 mAb-FITC、anti-CD3 mAb-PE/anti-CD25 mAb-FITC)结合流式细胞术分别检测T淋巴细胞早、中期活化标志--表面抗原CD69与CD25的表达,以活体荧光染料CFDA-SE标记结合流式细胞术检测细胞增殖并用MTT法佐证;以地塞米松(Dex)诱导细胞的凋亡,以荧光染料双色标记[DiOC6(3)/PI]结合流式细胞术区别凋亡、死亡与活细胞群。结果 Con A刺激后6 h和24 h,T细胞早期活化标志CD69和中期活化标志CD25分别大量表达,Con A刺激后48 h活化的T细胞增殖至第4代,而经终浓度为5、10、20μmol/L GB在Con A刺激前对细胞进行4 h预孵处理可以显著下调T细胞表面抗原CD69、CD25的表达并能有效抑制细胞增殖。Dex诱导后12 h细胞凋亡和死亡群显著增大,而经同样的GB预孵处理可以在一定程度上抑制细胞的凋亡进程,对细胞凋亡显示出一定的保护作用。结论 GB能有效抑制小鼠T淋巴细胞的活化与增殖,并且对细胞凋亡起到一定的保护作用,凭借GB对T细胞此3大行为出色的调节作用,理应将其作为天然的免疫抑制剂候选者进行更深入的研究。     

漆黄素对巨噬细胞和T淋巴细胞的免疫调节作用

目的探讨漆黄素(Fisetin,FIS)对小鼠巨噬细胞吞噬功能、NO的释放及对T淋巴细胞体外活化、增殖的影响。方法无菌制备小鼠巨噬细胞悬液及淋巴细胞悬液;荧光微球结合流式细胞术(FCM)分析FIS对巨噬细胞吞噬作用的影响;Griess试剂盒检测巨噬细胞NO的释放;双色荧光抗体染色结合FCM,检测CD3+T细胞CD69的表达水平;CFSE标记技术检测T细胞增殖的情况。结果 2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/LFIS均能明显抑制巨噬细胞的吞噬微球的能力;FIS能抑制LPS和IFN-γ刺激的巨噬细胞的NO的产生(P<0.05);FIS对ConA刺激的T细胞表达CD69有抑制作用,并能有效抑制ConA诱导的T细胞增殖(P<0.01),且均呈剂量依赖性。结论 FIS能显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力和分泌NO的能力,并能够抑制T细胞的活化和增殖,有望发展成为一种新的免疫抑制药物。     

大鼠肋生长板软骨细胞的分离、培养及生物学特性的研究

目的：建立大鼠肋生长板软骨细胞（RGC）分离、培养的方法，探讨其生物学特性，为软骨细胞增殖分化的调控和软骨组织工程修复的研究建立实验基础。 方法： 显微解剖出大鼠肋生长板软骨，酶消化法获得分散的单个RGC。观察单层培养的不同代数RGC的细胞形态变化,并进行细胞生长动力学分析；组织化学和免疫细胞化学方法检测不同代数RGC蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达。 结果： 本实验分离的RGC中活细胞比例大于98%；原代培养细胞呈多角形或圆形，第6代细胞仍保持多角的形态；前4代细胞的每日倍增指数随着传代次数的增加而增加，第5代后显著降低；原代培养的RGC中Ⅱ型胶原阳性染色细胞比例大于95%，阿尔新蓝染色也呈阳性；随着传代次数增加阳性细胞的比例下降。 结论： 本研究所建立的分离培养方法可以获得高纯度、高活性的软骨细胞，前3代RGC保持了在体软骨细胞的表型是研究软骨增殖分化调控的良好材料。     

体外培养对人皮肤角质形成细胞蛋白质组的影响

目的:探讨体外长期培养对人皮肤角质形成细胞蛋白质组的影响.方法:制备原代和第7代体外培养的人皮肤角质形成细胞的总蛋白样品进行双向凝胶电泳.采用PDQuest图像分析软件对获得的双向凝胶电泳图谱进行分析.串联飞行时间质谱鉴定选取的差异表达蛋白质点.半定量RT-PCR对差异表达蛋白质的mRNA水平进行确证.结果:获得了蛋白质分离效果较好的双向凝胶电泳图谱,串联飞行时间质谱鉴定选取的2个在第7代角质形成细胞中表达显著下调的蛋白质分别为PA-FABP(psoriasis-associated fatty acid binding protein 5)和Galectin-7,半定量RT-PCR确证第7代角质形成细胞中PA-FABP和Galectin-7的基因转录水平较原代角质形成细胞相应的基因转录水平显著降低.结论:体外长期培养人皮肤角质形成细胞可能影响一些与细胞的脂肪酸代谢及细胞凋亡相关蛋白的表达.     

一种检测小鼠T淋巴细胞中sjTRECs含量简易方法的研究

目的建立一种快速、简单的检测小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞的信号结合T细胞受体删除环(signal ioint TCR rearrangement excision circles,sjTRECs)水平的方法,并研究其准确性,以期推测初始T细胞含量从而评价胸腺功能。方法根据标准质粒荧光定量PCR的扩增曲线选择合适有效的扩增循环次数;优化PCR条件;梯度稀释的标准质粒(10^3—10^8拷贝)PCR扩增后使用图像分析软件包分析琼脂糖凝胶电泳的图像,测量PCR产物带的光密度,经统计获得标准曲线及方程。将样本的PCR产物带的光密度代入标准曲线方程,从而获得样本的sjTRECs水平读数,并和实时定量PCR结果比较。结果获得适合的PCR条件;成功建立可信度高的标准曲线;与实时定量PCR的检测结果比较,小鼠sjTRECs含量随年龄变化的趋势一致。结论成功建立研究方法,与实时定量PCR评价sjTRECs水平得到明显相似的结果,表明此方法可能成为TREC水平检测的一种有效可靠的分析方法。     

实时定量PCR评价小鼠胸腺功能方法的建立

目的建立实时定量PCR检测小鼠胸腺及脾脏T淋巴细胞中信号结合T细胞受体删除环（sjTRECs）水平的方法。推测其中的初始T细胞的数目,评价胸腺功能,从而为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。方法提取小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞基因组DNA,PCR扩增目的片段。纯化构建标准质粒的RAG2片段,构建标准重组质粒并鉴定。优化PCR体系后,实时定量PCR反应建立标准曲线,并检测不同品系（BALB／c和C57BL／6）成年小鼠胸腺及脾脏淋巴细胞sjTRECs含量。结果成功构建标准质粒。确定最适实时定量PCR反应条件后,在实时定量PCR中建立可信度高的标准曲线。建立的方法分析表明,这两个不同品系的sjTRECs含量统计学差异不显著。结论成功建立定量检测小鼠T淋巴细胞中sjTRECs含量从而推测其中的初始T细胞数目的方法。为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。