WDR5真核表达载体的构建及其在LNCaP细胞中的稳定表达

目的 构建人源WDR5全长结构基因真核表达载体, 建立稳定表达WDR5的LNCaP细胞株.方法PCR扩增WDR5基因, 将WDR5插入pCI-neo载体中, 酶切及测序鉴定重组质粒.利用脂质体转染法将重组质粒转染LNCaP细胞, Real Time-PCR检测转染细胞WDR5的m RNA表达水平.结果 经酶切及测序证实真核表达载体pCI-neo-WDR5构建正确.重组质粒转染到LNCaP细胞后, 用G418筛选获得稳定表达的细胞株, Real Time-PCR方法检测到WDR5基因在转录水平的表达.结论 PCI-neo-WDR5成功转染LNCaP细胞株中并稳定表达, 为下一步WDR5的深入研究及应用奠定了基础.     

逆转录多聚酶链反应对肠道病毒性脑膜炎、脑炎诊断价值探讨

目的探讨中枢神经系统感染的病原体及其检测方法。方法应用逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测６４例无菌性脑膜炎及２７例无菌性脑炎患儿脑脊液（ＣＳＦ）中肠道病毒（ＥＶ）ＲＮＡ。结果急性期ＣＳＦ中ＥＶＲＮＡ阳性检出率为：无菌性脑膜炎６０９％,脑炎４８１％;阳性患儿恢复期ＣＳＦ仅个别阳性;对照组全部阴性。起病５天以内阳性率明显高于５天以后（Ｐ＜００５）;５～１０月份较１１～４月份发病率高（Ｐ＜００５）。２５例病毒分离阳性者中２４例ＲＴ－ＰＣＲ阳性,５３例病毒分离阴性者中１９例ＲＴ－ＰＣＲ阳性,ＲＴ－ＰＣＲ敏感性显著高于病毒分离的敏感性（Ｐ＜００１）。结论ＥＶ是引起中枢神经系统感染的重要病原体,ＲＴ－ＰＣＲ技术是诊断ＥＶ感染的有效方法。     

儿童抗生素相关性腹泻诊断、治疗和预防专家共识

抗生素相关性腹泻(antibiotic-associated diarrhea,AAD)是抗菌药物使用后最常见的不良反应,尤其是儿童。AAD会延长原发疾病的恢复时间、增加医疗费用,重者可引起死亡。儿科医师对AAD关注不够,现组织国内呼吸、感染和消化领域专家,制定本共识,以提高我国儿童AAD诊治及预防水平,保障儿童健康。     

实时定量PCR技术与短时培养法检测尿样本HCMV的比较

目的建立实时定量PCR系统定量检测尿样本中HCMV并与短时培养快速诊断半定量法比较。方法根据HCMVul123基因保守区设计特异性引物和taqman探针,以GAPDH为内参照校准所检测样本的细胞数,建立实时定量PCR检测系统,定量检测132份尿标本中HCMV拷贝数与短时培养结果比较,并同时分析19例接受更昔洛韦治疗前后尿排毒量的变化。结果132份尿标本实时定量PCR结果:短时培养(-)组HCMVDNA为(83±155)拷贝/5×105细胞(n=16例),( )组为(571±231)拷贝/5×105细胞(n=26例),( )组为(792±303)拷贝/5×105细胞(n=35例),( )组为(1126±416)拷贝/5×105细胞(n=16例),( )组为(2201±1043)拷贝/5×105细胞(n=9例);19例38份更昔洛韦治疗前后尿样本中3例治疗前后短时培养结果无改变,而实时定量结果明显改变。结论实时定量PCR法比短时培养法更适于评价抗病毒疗效,而短时培养法判断HCMV是否为活动感染优于实时定量PCR法。     

M122蛋白与宿主因子Myst4的相互作用位点

目的 明确M122蛋白与宿主因子Myst4相互作用的位点.方法 以诱饵载体pGBKT7-M122为模板,采用PCR方法扩增不同长度大小的M122基因片段,并将其分别插入至pMD-T simple载体,构建含有不同长度M122基因片段的重组质粒.将构建成功的各个重组质粒分别用限制性内切酶EcoRI和SalI进行双酶切鉴定,并送测序.将测序正确的重组质粒采用同样的内切酶进行双酶切,凝胶回收试剂盒回收不同长度大小的M122基因片段,并将其分别亚克隆至pGBKT7-BD载体构建含有不同长度M122基因片段的诱饵质粒.将构建成功的各个诱饵质粒分别用限制性内切酶EcoRI和SalI进行双酶切鉴定,并送测序.将测序正确的各个诱饵质粒分别与pGADT7 -Myst4质粒共同转化至酵母菌株AH109感受态细胞,转化后的酵母细胞分别涂板于营养缺陷培养基SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板.M122与宿主因子Myst4相互作用的位点通过营养缺陷筛选确定.结果 成功扩增了编码不同M122蛋白突变体的基因片段,并将其正确插入诱饵载体,构建了含有不同长度大小M122基因片段的诱饵质粒;通过酵母双杂交筛选明确了M122蛋白与宿主因子Myst4相互作用的结合位点位于M122蛋白的1～ 148氨基酸.结论 M122蛋白的1～ 148氨基酸是其与宿主因子Myst4相互作用所必需的,为研究M122蛋白在MCMV致神经系统损伤的分子机制中的作用提供了实验基础.     

大蒜新素对鼠巨细胞病毒感染小鼠脾细胞IL-12 基因转录、表达和功能的影响

目的:阐明大蒜新素对鼠巨细胞病毒(MCMV)感染小鼠脾细胞TH1类细胞调控因子IL-12基因转录、表达和功能的影响和其在抗MCMV机制中的作用.方法:60只BALB/c小鼠随机分成大蒜新素治疗组(20只)、安慰剂组(20只)和正常对照组(20只).治疗组在造模后24 h开始腹腔注射大蒜新素一般剂量(25mg·kg-1),每天1次,共14 d;安慰剂组和正常对照组注射等量生理盐水.各组分别于治疗后第3,5,7,10,14天各处死4只小鼠,RT-PCR法检测各组小鼠脾细胞IL-12 p35,IL12 p40 mRNA表达强度;双抗体夹心ELISA法检测脾细胞培养上清中TH1细胞调控因子IL-12 p70蛋白和TH1类细胞因子IFN-γ的蛋白表达水平.结果:安慰剂组在感染后第3天IL-12 p70蛋白和IL-12 p35 mRNA表达显著增高,但第5天后急剧下降,显著低于正常小鼠;IFN-γ在感染后第3天达峰值,随后逐渐下降,在感染后第10～14天降至正常水平;而p40 mRNA则从感染第3天开始持续高水平表达.治疗组在治疗后第3天IL-12 p70蛋白,IL-12 p35,IL-12 p40 mRNA水平均显著增高达峰值(P＜0.05),但随后快速下降,在第5～14天稳定在正常细胞水平;IFN-γ亦在治疗后第3天表达至峰值,第5天稍有下降,但随后表达逐渐上调,在治疗后第7～14天显著高于安慰剂组和正常对照组(P＜0.01).结论:大蒜新素能完全纠正MGMV感染后第5～14天诱导的IL-12 p70蛋白和IL-12 p5 mRNA表达下调以及IL-12 p40 mRNA表达上调;同时还能持续上调IFN-γ表达,提示其还可能通过其他途径促进IFN-γ分泌.大蒜新素的上述作用有助于纠正MCMV诱导的TH1/TH2细胞网络失衡,增强特异性细胞免疫功能和抗病毒因子的分泌而有利于机体清除MCMV病毒,可能是其抗MCMV效应的另一作用机制.     

小儿病毒感染及抗病毒治疗小儿常见病毒感染的实验室诊断及评价

1病毒感染与病毒性疾病 病毒侵入人体的组织细胞内,借助宿主的细胞环境进行复制增殖,产生子代病毒,是谓病毒感染(viral infection).从病毒学来看,病毒在宿主细胞内完成复制过程,产生子代病毒,此时病毒处于活动状态,称作产毒性感染(productiveinfection);病毒在复制过程中,中途停止,成为不完整的病毒颗粒、或仅有病毒的DNA存在于细胞内、或与宿主细胞的DNA整合在一起,称为潜伏性或非产毒性感染(latent or non-productive infection).再从临床学来看,病毒侵犯宿主组织细胞,引起病变,临床上见到相应的症状、体征和功能损害的实验室依据,称为病毒性疾病,否则只能称作病毒感染.     

大蒜素注射液治疗小鼠巨细胞病毒性肝炎的实验研究

目的:验证大蒜素注射液(简称大蒜素)是否具有抗巨细胞病毒(CMV)的效应。方法:(1)观察空斑抑制率和人巨细胞病毒(HCMV)即刻早期抗原(IEA)表达水平,在体外评价大蒜素对 HCMV 实验毒株 AD_(169)和临床分离毒株的作用。(2)从肝组织病理变化、肝细胞功能(sALT)和肝组织内病毒基因表达水平三方面评价大蒜素对鼠巨细胞病毒(MCMV)肝炎模型小鼠的整体疗效。结果:(1)空斑抑制试验结果表明,大蒜素在细胞最大耐受浓度(MTC)时对 AD_(169)株的空斑抑制率达63.5%。用流式细胞仪评价 MTC 浓度大蒜素对 HCMV IEA 的抑制效应显示对7株临床分离毒株的抗原抑制率为43.3%～66.7%,平均58.4%,接近药物对 AD_(169)株的抑制效应(60.5%)。(2)6只接受药物治疗2周的小鼠肝组织病理改变和 sALT 异常程度明显低于未治疗模型组,肝组织内病毒基因表达水平亦明显低于后组。结论:大蒜素无论在体外细胞水平,还是在动物整体水平均具明显抗 CMV 效应。     

柯萨奇病毒B_3感染小鼠脑组织的钙超载及N-甲基-D-天冬氨酸受体I型mRNA高表达

目的　为探索肠道病毒性脑炎的发病机制 ,以柯萨奇病毒 (CV)B3 感染小鼠 ,观察其神经细胞内钙离子 [Ca2 ]i及脑组织N 甲基 D 天冬氨酸受体I型 (NMDAR1)mRNA表达的变化。方法(1)取新生Balb/c小鼠大脑皮质神经细胞 ,培养 12d后 ,于CVB3 感染 12h(12份 )用流式细胞仪检测细胞内 [Ca2 ]i,并用原子吸收光谱法检测神经细胞培养上清液中游离钙Ca2 含量 ;(2 )以CVB3 颅内接种小鼠 ,用NMDAR1的cDNA地高辛标记探针对感染 3d后处死的石蜡包埋脑组织切片作原位杂交检测。结果　 (1)感染 12h小鼠脑神经细胞内 [Ca2 ]i值较对照组明显增高 (P <0 0 1)。感染组神经细胞培养上清液中Ca2 含量低于对照组 (P <0 0 1)。 (2 )感染组脑组织中NMDAR1mRNA表达明显高于对照组 (P <0 0 1)。结论　CVB3 感染小鼠脑神经细胞可导致细胞内 [Ca2 ]i超载 ,且与Ca2 内流有关。CVB3 感染又可引起小鼠脑组织NMDAR1mRNA表达增高 ,其结果可能进一步引起Ca2 内流和神经兴奋性毒性作用损伤脑组织     

鼠巨细胞病毒抑制神经干细胞分化及分化基因表达的体外研究

目的 研究鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对体外培养神经干细胞(NSCs)分化及分化基因表达的影响,探讨CMV先天感染致神经损伤的机制.方法 体外分离培养和鉴定BALB/c胎鼠NSCs并检测其分化潜能,用感染复数(MOI)为5、1和0.1的MCMV Smith毒株感染NSCs并进行分化培养,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,流式细胞术检测分化细胞比率,免疫荧光法观察NSCs及其分化细胞标记物Nestin、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达的变化,采用MCMV早期抗原(EA)示踪感染过程(MOI=1),real-time RT-PCR检测分化早期NSCs Wnt信号途径关键分化基因Wnt-3和Wnt-Ta mRNA水平的动态变化.结果 体外培养的NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记Nestin表达阳性,并可进一步诱导分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞;分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,细胞Nestin表达下调缓慢并显著高于正常对照组,而GFAP和NSE表达显著低于正常对照组(P<0.05),可检测到MCMV EA的阳性表达;分化培养3-9 d,感染组Nestin阳性细胞比率显著高于正常对照组,GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于正常对照组(P<0.05);感染组Wnt-3 mRNA水平在分化培养后第1～2天显著低于正常对照组(P<0.05),感染组Wnto-7a mRNA水平在第0.5～2天明显低于正常对照组(P<0.05);感染组和正常对照组的差异随病毒MOI的增加而更加明显.结论 MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少;下调或干扰NSCs wnt信号途径分化基因wnt-3和Wnt-7a的表达;抑制NSCs分化及其分化基因表达的效应与MOI大小存在一定量效依赖关系;MCMV可能通过抑制NSCs分化基因的表达来抑制其分化,这可能是CMV先天感染致脑发育异常的重要机制之一.