小鼠巨细胞病毒即刻早期基因M122酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用的检测

目的构建小鼠巨细胞病毒(MCMV)即刻早期基因M122的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-M122,并检测其自激活作用及对酵母AH109菌株有无毒性作用,用于筛选小鼠胚胎脑cDNA文库。方法采用反转录(RT)-PCR的方法扩增MCMV的M122基因片段,并将其插入到pMD18-Tsimple vector,构建重组质粒pMD18-T-M122。用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ将重组质粒酶切鉴定,并测序。测序正确的pMD18-T-M122重组质粒和载体pGBKT7-BD分别用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切,凝胶回收M122基因片段及pGBKT7-BD载体片段。将回收的M122基因片段和pGBKT7-BD载体片段,用T4 DNA连接酶16℃连接过夜,构建诱饵质粒pGBKT7-M122。对pGBKTT-M122进行酶切鉴定,测序。将测序正确的pGBKT7-M122转化AH109酵母感受态细胞,转化菌液涂布于营养缺陷培养基SD/-Trp平板和SD/-Trp/X-α-Gal平板。空载体质粒pGBKT7-BD和阳性质粒pCL作为对照亦被转入AH109酵母感受态细胞,转化菌液分别涂布于SD/-Trp平板和SD/...     

大蒜新素降低鼠巨细胞病毒播散性感染小鼠病毒DNA载量研究

目的用大蒜新素治疗鼠巨细胞病毒（murine cytomegalovirus, MCMV）播散性感染小鼠至慢性期,检测小鼠唾液腺、肝、脾和肾组织内MCMV DNA载量动态变化,在整体水平上观察大蒜新素抗MCMV的长期疗效。方法BALB/c幼鼠60只,腹腔接种MCMV Smith株建立MCMV播散性感染模型,随机分为大蒜新素治疗组和模拟治疗组各30只,接种病毒后24 h,两组分别腹腔注射大蒜新素25 mg•kg-1•d-1和0.9%氯化钠注射液0.2 mL,qd,共120 d。于治疗后1,3,7,14,28,45,60,75,90和120 d,每组随机选择小鼠3只,取唾液腺、肝、脾和肾组织,采用real time PCR法检测组织内MCMV DNA载量。结果模拟治疗组小鼠唾液腺内MCMV DNA载量最高,在治疗后14 d（感染后15 d）达高峰;肝、脾和肾内病毒DNA载量治疗后7 d达峰值;治疗28 d（感染29 d）后,各组织内病毒DNA载量明显减少,尤其是肝、脾和肾组织病毒DNA呈持续低水平（进入慢性期）。与模拟治疗组比较,大蒜新素治疗组治疗后7,14和28 d唾液腺、脾和肾内MCMV DNA 载量显著降低;治疗后7和14 d肝内病毒DNA载量明显降低。进入慢性期后,两组小鼠各脏器病毒DNA载量差异无显著性。结论大蒜新素长期治疗不能完全清除CMV,但在急性感染期（病毒增殖高峰期）能显著降低脏器内病毒DNA载量。     

成人Still病的淋巴结病理诊断及临床意义

目的 观察成人Still病（AOSD）的淋巴结病理形态特点,探讨其在AOSD诊断中的临床意义.方法 对浙江省桐乡市中医医院病理科收治的4例AOSD患者的临床资料进行回顾性分析,并对其淋巴结活检及免疫组化标记结果进行观察分析.结果 患者主要表现为体温升高、皮疹及关节痛等临床症状,肝脾及淋巴结肿大,外周血白细胞较正常水平升高,EB病毒,HIV及抗RNP抗体正常.患者淋巴结部分结构保存,副皮质区增宽,淋巴结主要呈增生性改变,增生细胞主要是免疫母细胞及Langerhans细胞,可见小淋巴细胞及组织细胞等散在分布,增生细胞核分裂象较多见,且异型性明显.免疫组化标记结果显示,免疫母细胞表达CD20及CD79α或表达CD3及CD45RO,Langerhans细胞胞质及胞核、高尔基区,CD1a和vementin胞质阳性,活化的淋巴细胞表达CD30,组织细胞表达CD68,CD15及ALK等均无表达.结论 AOSD临床诊断不依赖于淋巴结活检,但淋巴结活检对AOSD的诊断具有重要的辅助价值,且肿大的淋巴结的免疫反应特点对AOSD的鉴别诊断也具有重要意义.     

Clinical efficacy and safety of chelation treatment with typical penicillamine in cross combination with DMPS repeatedly for Wilson’s disease

The aim of this study was to assess the clinical efficacy and safety of chelation treatment with penicillamine （PCA） in cross combination with sodium 2, 3-dimercapto-l-propane sulfonate （DMPS） repeatedly in patients with Wilson＇s disease （WD）. Thirty-five patients with WD were enrolled. They were administrated intravenous DMPS in cross combination with oral PCA alternately which was practiced repeatedly, all with Zinc in the meantime. During the treatment, clinical observations and 24-h urine copper excretion as well as adverse effects of medicines were recorded and analyzed. Although the incidence of adverse effects was not significantly different after either intravenous DMPS or oral PCA treatment, levels of 24-h urine copper tended to be higher after short-term intravenous DMPS than that of oral PCA. Adverse effects in the course of intravenous DMPS were mainly neutropenia, thrombocy- topenia, allergic reaction and bleeding tendency. As compared with oral PCA alone or intravenous DMPS alone, such repeated cross combination treatment could as much as possible avoid continued drug adverse effects or poor curative effect and had less chance to stop treatment in WD patients. Im- proved or recovered liver fimction in 71% of the patients, alleviated neurologic symptoms in 50% of the patients, and disappeared hematuria in 70% of the patients could be observed during the follow-up pe- riod of 6 months to 5 years after such combined chelation regimen. Chelation treatment repeatedly with oral penicillamine in cross combination with intravenous DMPS alternately could be more beneficial for WD patients to relieve symptoms, avoid continued drug adverse effects and maitain lifelong therapy.     

TLR3及其在皮肤纤维化疾病中作用的研究进展

免疫系统疾病中皮肤纤维化疾病受到越来越多的关注。文章就皮肤纤维化疾病相关的重要受体分子TLR3的组成、功能及其参与的信号转导途径进行了阐述和总结,并对其在皮肤纤维化疾病的机理研究进行了初步预测和分析,揭示了TLR3在纤维化疾病治疗和抗纤维化药物开发过程中具有理论指导、靶向研究作用。     

AIM2炎性体识别胞浆鼠巨细胞病毒DNA的实验研究

目的 观察AIM2( absent in melanoma 2)在感染早期识别胞浆小鼠巨细胞病毒(MCMV) DNA的变化状况.方法 建立MCMV全身播散型感染模型,接种MCMV Smith株后第1、3、5和7天各处死3只小鼠;同时设模拟感染小鼠作为正常对照.Western blot检测脾脏巨噬细胞中AIM2、衔接子凋亡相关点样蛋白(ASC)和caspase-1蛋白的表达状况;同时应用ELISA法检测血清中IL-1β和IL-18的水平;空斑法测定感染小鼠唾液腺感染性病毒滴度.结果 MCMV感染后第3、5、7天,小鼠唾液腺组织中感染性病毒滴度逐渐增加;MCMV感染鼠脾脏巨噬细胞中AIM2、ASC和caspase-1蛋白的表达呈现一致的变化,与模拟感染对照鼠比较,AIM2、ASC和caspase-1蛋白相对吸光值在感染后第1天开始升高(P＞0.05),第3天明显升高并达峰值[分别为(1.121±0.243) vs(0.240±0.046),(1.318±0.333) vs (0.248±0.090),(1.085±0.243) vs (0.247±0.064); P＜0.01],其后接近正常;MCMV感染鼠血清IL-1β和IL-18水平在感染后第3天也明显高于模拟感染对照鼠[分别为(112.72±5.20) pg/ml vs (47.86±4.35) pg/ml,(42.74±4.23) pg/ml vs( 22.60±2.82)pg/ml;P＜0.01],其后均逐渐下降接近正常.结论 MCMC感染早期巨噬细胞通过AIM2炎性体识别胞浆MCMV DNA,可能成为CMV感染及感染后所引起的疾病的治疗靶点.     

小鼠MCMV先天感染模型的构建及神经系统感染状况的观察

目的 建立小鼠巨细胞病毒(MCMV)先天感染模型,并观察其脑组织的病理变化及感染状况.方法 取孕11～13.5d的BALB/c鼠,模型组羊膜腔微量接种K181毒株(病毒量1×103 PFU),对照组注射DMEM培养液.单独饲养5d后处死孕鼠,剖宫取出胎鼠,麻醉处死,取胎鼠脑组织制作冰冻切片.胎脑组织切片常规HE染色,光镜下观察病理学变化;采用免疫酶组化及免疫荧光法检测脑组织中的MCMV早期抗原.结果 感染组胎鼠存活率为71.9％.与对照组相比,羊膜腔内接种MCMV病毒对胎鼠存活率、吸收胎率、死胎率及胎鼠头部重量无明显影响,但可致胎鼠体重降低.感染组胎鼠脑组织出现明显的病理变化.在宫内感染组,免疫酶学组化法发现脑室区、脑室管膜下区、大脑皮质和海马区可见病毒感染细胞;免疫荧光法观察到的主要感染部位与免疫酶组化法基本一致.结论 通过羊膜腔内注射MCMV病毒成功建立MCMV先天感染小鼠模型,为研究MCMV先天感染致脑发育异常机制提供合适的整体研究模型.     

小鼠巨细胞病毒感染神经干细胞的体外研究

目的研究小鼠巨细胞病毒(MCMV)对体外培养的神经干细胞(NSC)增殖和分化的影响,为研究先天性巨细胞病毒感染致脑发育异常的机制奠定理论基础。方法体外分离、培养和鉴定BABL/c胎鼠NSC,用含LacZ报告基因的重组小鼠巨细胞病毒RM461感染NSC,X-gal染色监测感染过程,透射电镜观察超微结构改变,PCR检测受染细胞及培养上清中病毒DNA及观察培养上清接种到小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的细胞病变效应,了解RM461对NSC的感染情况。通过绘制生长曲线、流式细胞术检测分化细胞比率,研究RM461对NSC增殖和分化的影响。结果RM461感染NSC48h后细胞出现肿胀、体积增大、神经球边缘的细胞发生脱落和死亡,细胞形态的改变随感染复数(MOI)的增加而更加明显;X-gal染色,24h受染细胞即可出现阳性改变,48h达高峰;RM461感染72h时,受染细胞及培养上清中病毒DNA呈阳性,培养上清接种到MEF后可出现明显的细胞病变效应,电镜下受染细胞胞浆中存在病毒颗粒,细胞器肿胀明显;RM461可明显抑制NSC的增殖和分化,当MOI为1时,分化培养2d,感染组胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇酶(NSE)阳性细胞的比例分别为(37.4±1.6)%和(8.9±0.8)%,远较未感染组[分别为(50.3±1.8)%和(23.4±1.3)%]低(P<0.01),且GFAP和NSE阳性细胞比率随MOI的增加降低更加明显。结论RM461可感染体外培养的NSC,并能形成产毒性感染;RM461可明显抑制NSC细胞的增殖和分化并导致干细胞死亡,这可能与先天性巨细胞病毒感染致脑发育异常有关。     

调节性T细胞与病毒感染

调节性T细胞是机体维持自身免疫耐受的重要组成部分,在免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡方面都有一定作用。近年来,人们认识到调节性T细胞在机体应对外来抗原的免疫机制中起重要作用,为此本文拟就调节性T细胞在外来微生物感染尤其是病毒感染中发挥的作用做一综述。     

WDR5真核表达载体的构建及其在LNCaP细胞中的稳定表达

目的 构建人源WDR5全长结构基因真核表达载体, 建立稳定表达WDR5的LNCaP细胞株.方法PCR扩增WDR5基因, 将WDR5插入pCI-neo载体中, 酶切及测序鉴定重组质粒.利用脂质体转染法将重组质粒转染LNCaP细胞, Real Time-PCR检测转染细胞WDR5的m RNA表达水平.结果 经酶切及测序证实真核表达载体pCI-neo-WDR5构建正确.重组质粒转染到LNCaP细胞后, 用G418筛选获得稳定表达的细胞株, Real Time-PCR方法检测到WDR5基因在转录水平的表达.结论 PCI-neo-WDR5成功转染LNCaP细胞株中并稳定表达, 为下一步WDR5的深入研究及应用奠定了基础.