单标记延伸结合荧光偏振技术快速检测B型流感亚系方法的建立及应用

目的建立一种单标记延伸（OLE）结合荧光偏振技术（FP）快速检测B型流感By和Bv亚系的新方法。方法从GenBank下载By和Bv血凝素（HA）基因各50条序列,通过MEGA软件进行分析,利用PrimerPremier5．0设计B型流感病毒亚系特异性引物和单标记延伸引物,RT-PCR扩增目的片段,用OLE引物添加亚系特异性荧光标记的双脱氧核糖核苷酸,建立单碱基延伸终止荧光偏振检测方法。结果RT-PCR扩增产物的大小分别为349、397和713bp。OLEsense引物检测Bv亚系双脱氧三磷酸胸苷（ddTTP）的FP值高于双脱氧三磷酸胞苷（ddCTP）的FP值（P〈0．01）。而By亚系则正好相反,ddCTP的FP值高于ddTTP（P〈0．01）;OLEanti—sense引物检测Bv亚系和By亚系ddGTP和ddATP的FP值均差别不大（均P〉0．05）。Bv样品毒株ddTYP的FP值均值为（159±10）mp,与Bv参照株（162mp）相近;By样品毒株ddCTP的FP值均值为（163±10）mp,与By参照株（165mp）相近。结论该方法操作简便、敏感性及特异性高、判读结果直观明确、检测费用低,适合于流感监测实验室对流感病毒的快速分子诊断。     

深圳市2008-2009年A型H1N1季节性流感病毒神经氨酸酶抑制剂耐药性监测

目的 对深圳市2008-2009年分离到的H1N1季节性流感病毒神经氨酸酶(NA)抑制剂的耐药性进行监测.方法 根据原始临床样本的采集时间,按周抽取了55株2008-2009年分离到的H1N1季节性流感病毒,对其NA片段进行全长测序,选取WHO推荐的疫苗株和部分国内外分离到的H1N1季节性流感病毒作为参考株,运用Mega3.1软件进行种系发生树的构建、耐药相关位点及糖基化位点的分析.结果 对NA片段的序列分析发现2008年有2株(7.1%)出现了H275Y突变,但是2009年则有25株(92.6%)出现了该突变.提示H275Y达菲耐药突变株成为了2009年深圳市社区传播的优势株.同时还发现了一株Q136K变异株,显示对乐感清出现耐药.分子进化分析结果显示,H275Y变异成为了毒株在系统进化树上分布的主要依据.所有的深圳株NA片段上潜在的糖基化位点序列保守.结论 大量H275Y达菲耐药株的出现提示在今后的工作中应当密切关注流感病毒的耐药进展,进一步加强其耐药机制的研究.

Abstract：

Objective To analyze neuraminidase(NA) inhibitor resistance of seasonal H1N1 influenza A viruses isolated in Shenzhen during 2008 to 2009. Methods The NA gene of these viruses were sequenced. Phylogenetic analysis of the sequences was performed with Mega3. 1 software. Results In 2008, most isolates of the seasonal H1 N1 virus were susceptible to neuraminidase inhibitors, but the H275Y mutation in the neuraminidase gene region associated with high-level oseltamivir resistance had been detected in 92.6% of the strains isolated in 2009. Furthermore, a strain with Q136K was found, which showed the resistance to Zanamivir. Conclusion In the light of emerging resistance, close monitoring and understanding of the nature and dynamics of resistance mutations in influenza virus should be a priority.     

2009年广东省深圳市B型流感病毒系统进化及分子变异分析

目的 了解2009年深圳市B型流感病毒的系统进化及分子变异情况。 方法 对2009年深圳市分离的B型流感病毒的时间分布进行统计分析,并通过MEGA等软件对其HA1基因的系统进化及分子变异情况进行研究。 结果 深圳市2009年1-10月均有B型流感病毒流行,3-5月为流行高峰;Victoria系分支D的毒株是优势流行株;与2008 - 2009年度的国际疫苗株相比,Victoria和Yamagata系的HA1分子在其抗原决定簇区均出现了多个氨基酸位点的变异。 结论 2009年深圳市B型流感病毒的流行时间长,一些氨基酸位点的变异并没有导致一个新流行株系的形成。     

用ARIMA模型预测流感的变化趋势

目的探讨ARIMA在建立流感预测模型方面的应用。方法利用深圳市2006—2008年每周的流感样病例（ILI）监测数据建立ARIMA模型,拟合ILI％的变化趋势,用残差序列分析进行模型诊断,用2009年的数据来检验ARIMA模型的预测效果。结果2006—2008年深圳市的ILI％呈季节性周期变化,经模型诊断发现ARIMA（1,0,0）×（1,1,0）模型为最优模型,预测值与实际值的平均相对误差为14．2％。通过对2009年数据的外推,2009年上半年的平均相对误差为15．5％,下半年的平均相对误差为25．5％。结论ARIMA模型可对ILI率进行很好的拟合,建模后的中短期预测效果较好。     

深圳市2005～2008年流感样病例暴发疫情特征分析

目的 了解深圳市流感样病例暴发疫情特征,为科学防控流感提供参考依据。方法回顾性分析深圳市2005～2008年流感样病例暴发疫情资料。结果深圳市2005～2008年累计报告流感样病例暴发疫情282起,累计发病人数3963例,平均罹患率为1．9％。全市六区均有流感样病例暴发疫情报告,234起（83．0％）发生于3-6月;245起（86．9％）发生于中、小学生人群;207起（73．4％）的疫情发病人数规模在15例以下。流感样病例暴发疫情主要由甲乙型流感病毒（80．5％,227／282）引起,其中90起（31．9％）甲型流感阳性、134起（47．5％）乙型流感阳性、3起甲乙型流感混合阳性（1．1％）。所有甲乙型流感PCR检测的阳性标本均立即接种MDCK细胞或鸡胚进行病毒分离培养,共分离流感病毒188株,溯源于71起疫情（71／227,313％）,其中15起为H1N1亚型、17起为H3N2亚型、39起为乙型流感病毒。3月份以乙型流感暴发为主,占72．7％,4月份甲乙型流感逐步更替,5~6月份则以甲型流感为主,占51．9％。结论深圳市流感样病例暴发疫情主要由甲乙型流感病毒引起,主要发生于3～6月,中、小学校是全市流感暴发疫情防控工作的关键所在。     

多重RT—PCR同步快速检测A型和B型流感病毒

目的　建立特异、敏感、快速、同步检测含漱液中A、B型流感病毒的分子生物学检测方法。　方法　以流感病毒A型保守的M基因和流感病毒B型的NS基因为模板分别设计的两对引物 ,用MRT -PCR同时扩增A型M基因和B型NS基因的片断 ,得到相对应的病毒片段 ,根据扩增出的片段的位置和大小来判断含漱液中A、B型流感病毒分型。　结果　用MRT -PCR从 19株A型流感病毒毒株和 11株B型流感病毒毒株分别特异地扩增出M基因 5 0 1bp的片段和NS基因 13 6bp的片段 ,灵敏度可达 1 6× 10 -5TCID5 0 ;对 2份黑天鹅的咽拭子和肺组织标本均检出A型流感病毒M基因 5 0 1bp的片段。　结论　多重逆转录聚合酶链反应能特异、敏感快速的检测A、B型流感病毒。     

2010-2011年深圳市流感样病例暴发疫情监测分析

目的 对2010-2011年深圳市流感样病例暴发疫情监测结果进行分析,了解流感的流行趋势,为流感防治提供科学依据. 方法 收集全市2010-2011年的流感样病例暴发疫情资料进行分析. 结果 2010-2011年深圳市共报告226起流感样病例暴发疫情.发病总人数为2026人,平均罹患率14.2％.疫情报告最多的月份是12月为64起,其次是3月和4月,分别为56起和39起.226起疫情中有201起(88.9％)为PCR检测流感病毒核酸阳性,经型别鉴定其中乙型171起(85.0％),甲流17起(8.5％),季节性甲型13起(6.5％). 结论 2010-2011年深圳市流感活动属于中等水平,分别在3-4月份和12月份出现流行高峰.     

EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒的构建

目的利用昆虫杆状病毒表达系统构建肠道病毒71型及柯萨奇病毒A16型(EV71/CA16)联合P1基因(HP1)重组杆状病毒。方法利用重叠PCR的原理,设计合成HP1基因;HP1基因与载体pFastBac1连接后转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组穿梭杆粒HP1-bacmid;提取纯化重组杆粒转染Sf9细胞,收获重组杆状病毒;以SDS-PAGE、Western blot进行重组蛋白鉴定。结果成功合成HP1基因;完成HP1与pFastBac1载体连接;获得了重组穿梭杆粒HP1-bacmid;并通过转染Sf9细胞,获得具有感染活性的重组杆状病毒;SDS-PAGE电泳结果显示重组病毒感染的Sf9细胞表达了大小约为100×103 Mr的目的蛋白条带,经Western blot鉴定,该条带能与EV71单克隆抗体特异结合。结论成功构建了EV71/CA16联合P1基因重组杆状病毒,为下一步EV71/CA16联合P1蛋白的免疫鉴定奠定基础,并为兼抗EV71、CA16疫苗的研究提供参考。     

2011-2012年深圳市呼吸道腺病毒分子分型及其流行特征

目的了解2011—2012年深圳地区致病性呼吸道腺病毒（AdV）的病原体基因亚型和遗传进化及其流行特征．分析深圳地区呼吸道腺病毒的流行规律和传播途径。方法收集2011年1月至2012年12月深圳地区31个流感样病例监测哨点2822份样本,先用荧光定量PCR方法筛查流感样病例,筛查后的阴性样本进一步进行呼吸道腺病毒等13种常见呼吸道病毒的核酸检测。对检测出的109份腺病毒阳性标本进行病毒分离,感染Hep-2受体细胞后共获得71份AdV稳定细胞毒株,用腺病毒六邻体基因作为靶基因,扩增其中的50份腺病毒阳性标本,纯化扩增产物后直接用于序列分析,在GenBank上进行序列比较,确定其病毒亚型并进行系统进化分析。结果2011—2012年深圳市腺病毒感染患者的高发年龄段人群为小于7岁的儿童,1～2岁婴幼儿发病率最高;4-6月和10—12月为每年发病高峰期。在2822份流感样病例咽拭子标本中,经定量PCR方法确定为AdV核酸阳性共109份,核酸阳性率为3．86％,从109份核酸阳性样本中分离病毒7l份,病毒分离率为68．93％。50份分离的呼吸道腺病毒分子分型结果为1型AdV6例,占12％;2型AdV4例,占8％;3型AdV27例,占54％;4型AdV3例,占6％;5型AdV4例,占8％;7型AdV5例,占10％;另外有复合型AdV（HAdV—un）1例,占2％。结论近两年来深圳地区呼吸道Adv感染以3型为主,腺病毒引起的呼吸道疾病主要发生在每年的4—6月,感染人群主要是1~2岁婴幼儿。     

B型流感亚系单碱基延伸终止荧光偏振快速检测的研究

目的 建立一种利用单碱基延伸终止结合荧光偏振技术(Fluorescence polarization,FP)快速检测B型流感By(B/Yamagata)和By(B/Victoria)亚系的新方法. 方法 从GenBank下载By和Bv血凝素(HA)基因各50条序列,通过MEGA软件进行分析,利用Primer Premier 5.0设计B型流感病毒亚系特异性引物和单标记延伸引物,建立单碱基延伸终止法与荧光偏振检测方法. 结果 40株By和40株By病毒用单碱基延伸终止法与荧光偏振检测,与传统的基因测序结果一致性达100％. 结论 本方法操作简便、敏感性及特异性高、判读结果直观明确、检测费用低,适合于流感监测实验室对流感病毒的快速分子诊断.