双重荧光定量RT-PCR快速检测流感病毒H1、H3亚型的研究

目的 利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测流感病毒H1、H3亚型的方法.方法 根据H1、H3亚型流感病毒HA基因的相对保守序列,设计两对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立优化反应体系后,将荧光定量RT-PCR的产物采用10倍稀释法,即107～100 copies/μl,再次用荧光定量PCR方法检验建立体系的灵敏度和重复性,并建立相对定量标准曲线;利用多种流感病毒和具有相似临床症状的呼吸道病毒检验建立体系的特异性.结果 H1和H3亚型流感病毒的检测灵敏度为102 copies/μl,扩增效率分别为101.35％和113.28％,标准曲线相关系数大于99％,重复性良好,特异度实验未发现有非特异性扩增.结论 本研究建立的双重荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地检测H1、H3亚型流感病毒.     

蛋白质组研究技术平台的建立——双向电泳条件的建立及优化

目的　建立和优化蛋白质组研究的双向电泳及相关技术。方法　以固相pH梯度等电聚焦为第一向和垂直SDS PAGE为第二向 ,对样品制备、上样量、IPG胶条、等电聚焦和聚丙烯酰胺凝胶电泳程序及参数、染色方法等相关技术进行了比较研究和条件优化。结果及结论　成功地得到了人胚肺成纤维细胞和蚕卵蛋白质组双向电泳图谱 ,建立了蛋白质组研究的双向电泳技术平台。     

转基因食品多重定性PCR及实时荧光定量PCR检测方法的研究

多重PCR方法是建立在传统PCR检测技术基础上的快速简便的检测手段。本研究以国际市场上转基因食品的主流产品转抗除草剂大豆 (RR大豆 )、Bt176玉米及我国自行研发的抗菌肽辣椒为材料 ,以多重PCR方法为基础 ,通过基因片段筛选及引物比例调整 ,进行了转基因食品的调控元件、外源结构基因及物种内源特性基因三种片段的单管同时扩增。结果与常规PCR方法检测结果完全相符。同时 ,针对RR大豆 ,对几类大豆产品运用实时定量PCR方法进行定量分析 ,得到相应的转基因成分的含量。操作简便快速 ,检测结果与标准相符 ,检测灵敏度较常规PCR更高。     

应用RT-PCR方法检测人与动物的SARS冠状病毒

目的选择合适的RTPCR检测方法应用于人和与人类生活密切相关的多种野生、圈养和市售动物携带SARS样冠状病毒的检测,探索SARS样病毒的来源。方法收集深圳SARS临床诊断病例、疑似及观察病例咽漱液标本共350份,分别用TaqMan和分子信标荧光RTPCR法进行检测;收集386只动物的咽肛拭子样本及病毒分离培养物共442份样品进行了TaqMan荧光RTPCR和普通RTPCR法的检测。结果41例临床确诊病例荧光RTPCR法检出10份阳性,阳性率24.39%,TaqMan法和分子信标法检出结果8份符合(符合率88.89%)。对动物样本病毒分离培养物细胞病变样本18份进行检测,检出16份阳性,其中14份(87.5%)样本来源为果子狸。深圳东门市场及广东周边地区市场及养殖场动物样本检测结果:果子狸、貉及獾类动物总的阳性率为39.02%,而其它动物的阳性率为0,两者间差异具有显著性(P<0.01);对东门市场109只主要野生动物咽肛拭子样本进行PCR检测,阳性率44.04%,而145只野外的野生动物阳性率仅为0(P<0.01)。结论TaqMan法和分子信标法均可用于SARS检测;动物中尤其是果子狸等野生动物可能携带有SARS冠状病毒。     

烹调油烟多环芳烃暴露与职业接触人群DNA氧化性损伤

目的 通过调查不同组别厨师和非暴露组尿中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的排泄量,研究8-OHdG和1-羟基芘(1-OHP)之间的关系.方法 采集不同组别厨师组(n=86)和非暴露对照组(n=36)的尿液样本,观察对象均为年龄22～28岁男性,并有相似的吸烟习惯.在采样之前24 h内,以问卷调查的形式对研究对象的身体健康状况、职业史、吸烟习惯和酒精消费量进行评估.冷藏尿液样本,随后通过高效液相色谱法分析8-OHdG和1-OHP水平.结果 对照组尿液中8-OHdG的排泄量(平均1.2μmo1/mol肌酐,n=36)与厨房里有排烟设备运转的厨师组相似(平均1.5 μmol/mol肌酐,n=45).与对照组相比,接触油烟而排烟设备没有运转的厨师组,其尿8-OHdG的排泄量明显增加(平均2.3 μmol/mol 肌酐,n=18).经多元回归分析,尿ln 1-OHP和ln 8-OHdG的水平仍然呈明显的正相关.结论 接触油烟中的多环芳烃(PAH)或其他化合物可能导致DNA氧化损伤.     

2009年深圳新甲型H1N1流感病毒分离鉴定及分离株特征分析

目的比较新甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞和鸡胚的敏感性差异,了解病毒分离株特征,为疫苗制备和开展实验室常规监测等奠定基础。方法用MDCK细胞和鸡胚进行流感病毒分离[1],收获病毒后提取病毒RNA,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增,阳性扩增产物纯化后测序,测序结果使用Clustal和MEGA4.1软件进行比较分析,通过与NCBI数据库中不同时间和地区的流感病毒H1N1株同源比对后,绘制种系发生树。结果从334份患者呼吸道标本中,用MDCK细胞分离法分离出134株新甲型H1N1病毒,分离率为40.12%,用鸡胚分离法分离出150株新甲型H1N1病毒,分离率为44.91%;所测10株新甲型H1N1毒株HA1区的344个氨基酸,与2009年新甲型H1N1国际代表株A/California/07/2009相比,只有少数位点发生氨基酸替换,并且这些位点都不在抗原决定簇上;种系发生树显示,10株新甲型H1N1和国际代表株同源性较大,形成一簇,与A/Swine/guangxi/13/2006较为接近。结论新甲型H1N1病毒对MDCK细胞和鸡胚的敏感性相差不大;新甲型H1N1病毒未发生变异,短期内不会产生新变种。     

泛太平洋西岸地区部分H5N1亚型禽流感病毒毒株血凝素基因特性的研究

目的了解泛太平洋西岸各个国家H5N1亚型人禽流感病毒血凝素(HA)基因分子特征,寻求HA基因变异规律。方法从Genebank中下载泛太平洋西岸国家或地区(包括泰国、越南、香港、印度尼西亚、中国大陆、蒙古、俄罗斯)50株H5N1亚型高致病性流感病毒(HAPI)毒株血凝素基因序列,利用生物信息学软件DNASTAR5.0进行核酸同源性分析,用MEGA3.1进行核酸和氨基酸序列比对和进化树分析。结果50株高致病性H5N1亚型流感病毒毒株可以分成3个相对独立的进化簇。第1簇为泰国越南簇;第2簇为中国印尼北亚簇(包含中国、印度尼西亚、蒙古以及俄罗斯);第3簇主要为1996~2001年期间分离的毒株,该簇毒株HA基因与Gs/Gdlike毒株核酸同源性更为接近,其基因亚型更多表现为Gs/Gdlike或其他基因亚型。HA基因分子特征分析表明在HA蛋白抗原性上,泰国越南分离株表现基本一致,而其他地域分离株存在表现各异,但也存在地域的一致性。结论泛太平洋西岸地区分离的H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白在分子特征上表现出一定的地域特异性,在一定地域范围内保持一致性。     

深圳市SARS临床诊断病例血清学及病原学实验研究

严重急性呼吸综合症（severe acute respiratory syndrome,SARS）是一种新的急性呼吸道传染病.该病于2002年11月16日最早发现于广东省佛山市,随后广东多个城市均出现SARS病例.广东省共发生SARS病例1 511例,死亡58例.我国共发生SARS病例5 326例,死亡346例.全世界共32个国家和地区出现SARS病例8454例,死亡792例.2003年2月下旬,香港、德国和美国的实验室通过病毒分离培养、电镜、RT-PCR检测和免疫荧光抗体检测,发现一种新型的冠状病毒（又称SARS病毒,SARS-Cov）,是导致SARS的病原体.